[发明专利]一种高通量定量和定性分析蛋白质的方法

说明书

本发明公开了一种高通量定量和定性分析蛋白质的方法，为同位素标记和数据非依赖采集两者结合高通量定量和定性分析蛋白质。采用本发明提供的方法定量分析蛋白质，结果准确；适用于分析各种样本类型(如血浆样本、组织样本)且无需细胞培养。本发明具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高通量定量和定性分析蛋白质的方法，尤其涉及结合同位素标记和数据非依赖采集的方法高通量定量和定性分析蛋白质。

背景技术

在蛋白质组学研究中，常用的质谱扫描方式有数据依赖采集(data-dependentacquisition，DDA)和数据非依赖采集(data-independent acquisition，DIA)两种模式。DIA结合了DDA和选择反应监测(Selected reaction monitoring，SRM)的特点，将整个扫描范围等分为若干窗口，每个窗口依次选择，碎裂，采集窗口内所有母离子的全部子离子的信息。所以，DIA能够获得扫描范围内所有母离子及二级子离子信息，不会造成低丰度离子信息的丢失，同时突破了高分辨质谱二级定量的通量限制。与DDA相比，DIA具有更好的重现性、更高的灵敏度和更少的缺失值，在定量蛋白质组学中具有良好的应用。因此，DIA特别适用于复杂临床样本(如血浆、脑脊液)的大规模分析，因为这些样本中含有大量动态变化的蛋白质。

随着定量蛋白质组学不断发展，高通量分析需求不断增加，尤其是临床样本的大规模分析。当前DIA数据在质谱采集时间上，通常为血液样本1针1小时，组织类样本1针2小时。除去仪器的维护时间，一天仅仅能分析10个血液样本或者5个组织样本。较低的分析通量大大限制了大规模队列研究的开展。提高蛋白分析的通量对大规模蛋白质组学分析的开展意义重大。

现有的提高DIA通量方法主要是基于质量亏损(NeuCode)的标签与DIA耦合，一次可以平行分析多个样品，从而提高通量。基于质量亏损的标签，主要包括体内标志和体外标志。2015年，Joshua研究者将Neucode SILAC技术与DIA技术耦合起来，即NeuCoDIA技术，具体原理为将质量相差36mDa的重标1和重标2赖氨酸以10：1的比例分别培养细胞，培养一段时间后，提取蛋白，用赖氨酸消化酶进行消化；LC-MS/MS检测时，进行DIA采集，分离窗口设置为27Th，因此相差36mDa的两个峰保证在同一个分离窗口，可以进行共分离和共碎裂。保证了同一个肽段的两个同位素峰产生的y离子同时出现在同一个MS2谱图，进而可以进行相对定量分析。2017年，鲁豪杰基于Neucode SILAC技术，通过对标签进行一定修改后，与DIA技术耦合，实现了4标通量，称为MdFDIA技术。MdFDIA技术的原理：赖氨酸重标和轻标分别培养细胞，然后用赖氨酸消化酶进行消化，得到的肽段再用甲醛进行二甲基化处理，由于甲醛分别用重标和轻标同位素进行标志，这样得到了4种不同质量的肽段，质量差为5.8mDa；进行DIA采集，分离窗口设置为27Th，因此相差5.8mDa的两个峰保证在同一个分离窗口；可以进行共分离和共碎裂；保证了同一个肽段的两个同位素峰产生的y离子同时出现在同一个MS2谱图，进而可以进行相对定量分析。NeuCoDIA技术和MdFDIA技术都是通过代谢途径(细胞培养)对肽段的赖氨酸进行标记来实现通量提升，对于不适合细胞培养的则不适用。同时，嵌入赖氨酸同位素的标记需要特定的Lys-c消化酶酶切产生含有赖氨酸残基的片段用于定量，这导致与胰蛋白酶酶切相比，鉴定的蛋白数量减少。

发明内容

本发明的目的是高通量定量和定性分析蛋白质。

本发明首先保护一种高通量分析蛋白质的方法，可包括如下步骤：

(1)分别提取若干目标样本的蛋白，之后酶解，获得酶解肽段；

(2)完成步骤(1)后，分别用质量数相差大于50Da的标签标记来自不同样本的肽段；

(3)将步骤(2)标记的肽段进行LC-MS/MS检测，采用DDA模式采集数据，构建DDA谱图数据库；