[发明专利]一株适用多种感受态制备方法的高效价大肠杆菌克隆菌株及其应用

说明书

本发明公开了一株适用多种感受态制备方法的高效价大肠杆菌克隆菌株，该菌株命名为BW3KD，是以大肠杆菌野生株BW25113为出发菌株，通过敲除其基因型中的基因endA、FhuA和DeoR制得。本发明还公开了所述BW3KD菌株在用于制备高效价的大肠杆菌感受态细胞实现DNA的高效转化中的应用。实验证实，本发明的菌株适合于各种感受态制备方法，其效价在其他大肠杆菌中都处于较高位置；基于优化的TSS‑HI法与BW3KD菌株结合其感受态效价可以稳定达到7.21×10⁹±1.85×10⁹CFU/μg DNA；有效解决了不同大肠杆菌制备感受态细胞其效价差异明显的问题；同时该菌株具有生长快的优势，转化当天7h就可以长出单克隆，大大节省了克隆时间，应用前景和经济价值巨大。

技术领域

本发明涉及一株大肠杆菌克隆菌株及其应用，尤其涉及一株适用多种感受态制备方法的高效价大肠杆菌克隆菌株及其应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

DNA克隆是克隆中常用的技术，对分子生物学的发展具有里程碑的意义。目前为了高效DNA克隆也相继开发了多种大肠杆菌作为DNA克隆的宿主，其中多数的大肠杆菌都是属于K-12系。

已有的DH5α是比较常用的克隆型菌株；XL1-Blue MFR’中限制性修饰系统hsdSMR的去除使其更适合克隆甲基化的DNA；Stbl2是来源于克隆型菌株JM109，Stbl3是K系和B系的商业合成菌株，两株菌均被用于带有重复序列DNA克隆；W系菌株Mach-1由于生长优势也常被用于DNA克隆的宿主菌；B系菌株BL21是用于蛋白高效表达的菌株。

将目的DNA片段转化进入宿主菌是进行DNA克隆的关键步骤。目前常用的两种方法为化学转化和电转化。电转化方法效价可以达到10¹⁰CFU/μg DNA，但它不常用于体外DNA克隆，因为组装的DNA在含有离子的含酶混合物里会使电穿孔效率明显降低，因此必须在电穿孔前进行DNA的纯化，但纯化过程中的DNA损失可能会导致克隆效率低下。因此，化学方法制备的感受态细胞是通常用于体外DNA克隆方法的最好选择。目前常用高效价的化学方法有Hanahan法、Inoue法和TSS法。在标准实验条件下，对于hanahan法比较适用的菌株包括DH5a、JM109和XL1-Blue其效价能达到10⁸CFU/μg DNA，而对于TOP10和SCS110其效价只能维持在10⁵CFU/μg DNA；对于不同的宿主菌Inoue法制备感受态得到的效价范围在5×10⁷-3×10⁸CFU/μg DNA，而TSS法基本维持在10⁷CFU/μg DNA。在目前感受态制备方法比较成熟的条件下，仍然存在所述方法对各种菌株适用性不强的问题，因此感受态效价的高低除了依赖感受态制备方法，也依赖于选取的大肠杆菌宿主菌，故确定一株适用感受态制备方法的宿主菌对感受态效价的提高至关重要。

经检索，目前在常用的克隆菌株中，能够广泛适用多种感受态制备方法的高效价大肠杆菌克隆菌株及其应用还未见报道。

发明内容

在目前已经广泛认可的感受态制备方法下，针对不同大肠杆菌制备感受态细胞其效价差异明显的问题，本发明的目的是提供一株适用多种感受态制备方法的高效价大肠杆菌克隆菌株及其应用。

本发明所述的适用多种感受态制备方法的高效价大肠杆菌克隆菌株，其特征在于：该菌株命名为BW3KD，是以大肠杆菌野生株BW25113为出发菌株，通过敲除其基因型中的基因endA、FhuA和DeoR制得。

上述适用多种感受态制备方法的高效价大肠杆菌克隆菌株的构建方法，步骤是：