[发明专利]丙酮酸脱氢酶的突变体及其用于生产L-氨基酸的方法

说明书

本发明提供的丙酮酸脱氢酶突变体，其在氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的基础上，且其217位突变为丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸中的任一个。所述突变体可以提高菌株L‑氨基酸的产量和转化率，且在提高产量的同时，没有抑制菌株的生长，为大规模生产L‑氨基酸提供了新的途径，具有较高的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种丙酮酸脱氢酶的突变体，编码该突变体的多核苷酸，含有该突变体的宿主细胞，以及利用该突变体生产L-氨基酸的方法。

背景技术

丙酮酸脱氢酶多酶复合物（PDHC）是一组限速酶，在谷氨酸棒杆菌中，PDHC催化糖酵解过程产生的丙酮酸不可逆地氧化脱羧转化成乙酰辅酶A，将糖的有氧氧化与三羧酸循环和氧化磷酸化连接起来，是三羧酸循环的关键酶。PDHC由丙酮酸脱氢酶（E1p）、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶（E2p）和二氢硫辛酰胺脱氢酶（E3p）组成。酶具有无活性（磷酶化）和有活性（去磷酸化）两种形式，这一点与磷酸化酶不同。有多种别构调节剂调控二种酶形式的转换，并受激素活动影响。

其中，E1p酶由aceE基因编码。已有报道弱化AceE的表达可以提高棒杆菌L-氨基酸的产量。CN106715687A也报道了AceE 190-205位或415-440位的任一氨基酸突变可提高谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸的产量。目前，尚未有新的突变位点被报道。

发明内容

本发明根据对AceE结构预测的结果，对217位进行了饱和突变，发现部分突变体可显著宿主细胞L-赖氨酸的产量，在此基础上，完成本发明。

本发明的目的是提供一种新型的丙酮酸脱氢酶突变体，含有该突变体的宿主细胞，以及利用含有该突变体的宿主细胞生产L-赖氨酸的方法。

第一方面，本发明提供了一种新型的丙酮酸脱氢酶突变体，所述突变体为：

1）氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，且其217位为丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸中的任一个。

2）与SEQ ID NO:1同源性高于90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的多肽，且在对应于SEQ ID NO:1的217位为丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸中的任一个。

3）在SEQ ID NO:1所示多肽的两端添加、缺失一个或多个碱基，且在对应于SEQ IDNO:1的217位为丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸中的任一个。优选地，在SEQ IDNO:1所示多肽的两端添加、缺失1、2、3、4、5、6个碱基。

第二方面，本发明提供了编码丙酮酸脱氢酶突变体的编码多核苷酸。

第三方面，本发明提供含所述的丙酮酸脱氢酶突变体的编码核苷酸的表达盒。所述编码核苷酸与启动子可操作连接。

第四方面，本发明提供了含有丙酮酸脱氢酶突变体的编码核苷酸的载体，尤其是表达载体。

第五方面，本发明提供了含有丙酮酸脱氢酶突变体的编码核苷酸的宿主细胞。

进一步地，所述宿主细胞包括但不限于埃希氏杆菌属(genus Escherichia)、欧文氏菌属(genus Erwinia)、沙雷氏菌属(genus Serratia)、普罗维登斯菌属(genusProvidencia)、肠道菌属(genus Enterobacteria)、沙门氏菌属(genus Salmonella)、链霉菌属(genus Streptomyces)、假单胞菌属(genus Pseudomonas)、短杆菌属(genusBrevibacterium)、棒状杆菌属（genus Corynebacterium）的微生物。可选地，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌。优选地，所述宿主细胞包括但不限于谷氨酸棒杆菌ATCC13032，谷氨酸棒杆菌ATCC13869、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067及其衍生菌株。