[发明专利]多型杜氏藻盐胁迫响应miRNAs及其应用

权利要求书

1.多型杜氏藻(Dunaliella polymorpha)盐胁迫响应miRNAs，其特征在于，包括：dpa-mir3、dpa-mir16、dpa-mir17、dpa-mir26、dpa-mir40，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～5所示。

2.用于扩增权利要求1所述的miRNAs的荧光定量PCR反应的特异性引物，其特征在于，所述引物包括：Dp-18SrRNA-S、Dp-18SrRNA-A、dpa-mir3-A、dpa-mir3-S、dpa-mir16-A、dpa-mir16-S、dpa-mir17-A、dpa-mir17-S、dpa-mir26-A、dpa-mir26-S、dpa-mir40-A、dpa-mir40-S，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.6～17所示；其中Dp-18SrRNA-S、Dp-18SrRNA-A分别为多型杜氏藻miRNAs荧光定量PCR反应所用内参基因18SrRNA的上下游引物。

3.权利要求1所述的多型杜氏藻盐胁迫响应miRNAs的stem-loop引物，其特征在于，包括：Dpa-MIR3-RT、Dpa-MIR3-F、Dpa-MIR16-RT、Dpa-MIR16-F、Dpa-MIR17-RT、Dpa-MIR17-F、Dpa-MIR26-RT、Dpa-MIR26-F、Universal，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.8～15、SEQ IDNO.18所示。

4.一种基于权利要求1所述的miRNAs或基于权利要求3所述的stem-loop引物的多型杜氏藻株耐高盐品系筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，不同多型杜氏藻株的盐胁迫处理；具体为：选取采自不同地区的多型杜氏藻株D.polymorpha_C33、D.polymorpha_C43、D.polymorpha_C48、D.polymorpha_CN1、D.polymorpha_CN2、D.polymorpha_CN3、D.polymorpha_Large、D.polymorpha_Small，在培养至第30天时，分别添加1.0mol/L、2.0mol/L、3.0mol/L的NaCl进行胁迫，对照组除培养基正常生理盐度0.05mol/L NaCl外，不再添加NaCl，各胁迫48h；

步骤2，对步骤1处理后的各组多型杜氏藻株进行总RNA提取及反转录；具体包括以下步骤：

2.1分别将各组无菌的300-500mg藻株放入预冷的研钵中，加入5-8mL液氮充分研磨15s后置于无菌EP管中；

2.2向EP管中加入1mL Trizol溶液，再加入250μL体积比为24∶1的氯仿/异戊醇，剧烈震荡20s后于4℃、12000r/min离心8min，将上清转至另一无菌EP管中；

2.3分别用与上清等体积的体积比为25∶24∶1的饱和酚/氯仿/异戊醇和体积比为24∶1的氯仿/异戊醇各抽提一次；

2.4抽提后的总RNA沉淀物用2.5倍体积的4℃预冷的无水乙醇沉淀20min，75％乙醇洗涤2次后在无菌环境中晾干；

2.5将步骤2.4晾干的RNA溶解于30～50μL DEPC处理的超纯水中；

2.6用1.5％琼脂糖电泳检测RNA，用紫外-可见光分光光度计检测RNA质量，质量合格的RNA，即28SrRNA和18SrRNA条带清晰，OD260/OD280值在1.9-2.0，用DEPC处理的超纯水稀释至25ng/μL；

2.7使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，反转录反应体系为：RNA 2μL、RT引物0.5μL、5×TS II All-in-One SuperMix for PCR 4μL、RNase-free Water补齐至20μL；反转录条件为：25℃5min；42℃20min；85℃，10min；4℃，5min；

所述RT引物包括Dpa-MIR3-RT、Dpa-MIR16-RT、Dpa-MIR17-RT、Dpa-MIR26-RT，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14所示；

步骤3，不同品系多型杜氏藻株盐胁迫响应miRNAs的qPCR扩增；扩增体系为：步骤2的反转录产物2μL、F引物0.5μL、Universal引物0.5μL、2×Rotor-Gene SYBR Green PCR MasterMix 10μL、超纯水7μL；反转录条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃复性20s；72℃延伸20s；40个循环，溶解曲线检测；

所述F引物包括Dpa-MIR3-F、Dpa-MIR16-F、Dpa-MIR17-F、Dpa-MIR26-F，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15所示；所述Universal引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

步骤4，使用2^-△△CT值计算miRNAs的相对表达量，从而筛选出耐高盐多型杜氏藻株品系。