[发明专利]一种用于人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白（VASP‑P）光激化学发光均相免疫检测试剂盒及其检测方法，其中，所述试剂盒包括组份SA‑GG、组份Bio‑Ab、组份FG‑Ab、样本前处理缓冲液、含PGE1的样本激活剂和含PGE1+ADP的样本抑制剂。本发明的试剂盒采用均相免疫，利用光激化学发光分析方法与光激化学发光检测仪配合，用于测定人体样本中的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白含量，与目前VASP检测主流技术流式细胞技术相比，对操作人员要求较为简单及仪器费用较低，与ELISA等非均相免疫分析相比，检测范围宽，操作简单，检测时间短，灵敏度高，重复性好。

技术领域

本发明涉及用于人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒及其检测方法，属于分子免疫学领域。

背景技术

人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白（VASP）属于Ena/VASP蛋白家族，是一种血小板胞内肌动蛋白调节蛋白。其存在2个重要的磷酸化位点，分别为：丝氨酸157和丝氨酸239，这两个磷酸化位点的磷酸化状态与血小板的活化功能密切相关。丝氨酸157磷酸化位点的磷酸化可以抑制人血小板中纤维蛋白原与糖蛋白IIb/IIIa的结合；丝氨酸239磷酸化位点主要存在于完整的人内皮细胞及血小板上，其磷酸化以应答药理和生理的血管舒张剂和血小板抑制剂。血管舒张刺激磷蛋白是血小板内P2Y12受体特异性活化标志物，抑制其磷酸化；当存在ADP受体拮抗剂时，VASP磷酸化产物增多，进而抑制血小板的活化。

氯吡格雷对血小板的抑制作用主要通过特异性阻断ADP与血小板膜上P2Y12受体结合而起效，P2Y12受体被抑制则血管舒张刺激磷蛋白磷酸化，表现为血小板抑制；去磷酸化则血小板活性恢复。血管舒张刺激磷蛋白磷酸化是P2Y12活化途径的关键环节，对其量化分析是针对P2Y12通路的特异性检测方法，且测量结果具有良好的稳定性，量化检测血管舒张刺激磷蛋白的磷酸化水平可特异性地评价氯吡格雷对血小板的抑制程度。

目前VASP检测主流产品为stago公司的PLT VASP/P2Y12，需要采用流式细胞仪进行检测，流式细胞技术和操作对人员和机器的要求较高导致花费较为昂贵、Stago公司也提供检测VASP的试剂盒，但反应时间较长，操作繁琐。

而文献中也公开了一些VASP的新的检测方法，中国专利CN106370839A公开了一种快速检测的量子点免疫层析试纸条。试纸条将磷酸化VASP单克隆抗体和量子点偶联物喷涂在玻璃纤维素膜上得到探针固定垫，VASP单克隆抗体包被在检测膜检测线上，羊抗鼠多克隆抗体包被在检测膜的质控线上。

CN108982861A公开了一种酶促化学发光血管扩张型刺激磷蛋白检测试剂盒。用包被有VASP单克隆抗体的磁颗粒和辣根过氧化物酶（HRP）标记VASP-P抗体Ⅱ，在与待测标本中相应的抗原发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物（发光剂），酶催化和分解底物发光。

以上三种发光免疫分析方法，均属于非均相免疫分析。非均相免疫分析在检测信号前，需要通过反复洗涤固相(微粒)，以分离去除分布于液相中的未参加反应的标记抗体。多次洗涤必然会为免疫分析带来洗涤“误差”，影响分析方法的精密度，从而影响分析方法的准确度和分析敏感度。并且反复洗涤与检测周期、检测成本都有较为直接的关系，因此，设计一种均相的免疫分析法用于VASP的检测，是十分有必要的。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得用于人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒及其检测方法，避免了酶联免疫试剂盒存在的线性范围窄、操作繁琐等缺点，且解决了灵敏度低、稳定性差等缺陷。

为实现上述发明目的之一，本发明采用的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒的技术方案如下：