[发明专利]一种用于抑制采后果实腐败病原菌的含铁离子菌悬液及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于抑制采后果实腐败病原菌的含铁离子菌悬液及其制备方法和应用。通过在一定培养阶段的芽孢杆菌菌悬液中添加金属铁离子提高芽孢杆菌生物膜的形成及抑制果实腐败菌的能力。在体外，含有金属化合物的菌悬液对水果腐败菌(扩展青霉、灰葡萄孢霉)的抑制效果显著增强；在体内，对樱桃番茄、枇杷、梨贮藏中腐败菌(扩展青霉、灰葡萄孢霉)的抑制能力明显提升。本发明建立生防菌株解淀粉芽孢杆菌B4(Bacillus amyloliquefaciens B4)生物被膜形成与其在生防作用中的联系，外源添加金属化合物显著提高解淀粉芽孢杆菌B4生物被膜形成能力和对青霉、灰霉的体内及体外抑制作用；操作简单，易于实用，有助于解淀粉芽孢杆菌产品化。

技术领域

本发明涉及生防细菌在果实采后病害的生物防治技术领域，具体是一种用于抑制采后果实腐败病原菌的含铁离子菌悬液及其制备方法和应用。

背景技术

生物被膜是附着于惰性或活体表面的结构性细菌群落，其中的细菌被包裹在水合胞外聚合物基质网中。胞外聚合物主要是由多糖、蛋白质、核酸和脂质组成，它们为生物被膜提供了机械稳定性，使细菌细胞互相连接并暂时固定不动。而胞外聚合物中营养物质的交换使得细菌形成相当厚度生物被膜的同时，仍保持单个细胞在最佳营养状态。

枯草芽孢杆菌作为一种非致病性革兰氏阳性菌，已成为研究生物被膜形成的模式生物。枯草芽孢杆菌具有复杂的调控网络，可以响应不断变化的环境条件来协调生物被膜基质相关基因的表达。研究显示枯草芽孢杆菌生物膜形成能力越强，防治植物病害效果越显著。因此，研究生物膜的形成能力及形成条件将有助于今后生防细菌的遗传改良研究及合理使用。

解淀粉芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，与枯草芽孢杆菌亲缘性高，广泛分布于自然环境中。由于具有广谱的抑制真菌和细菌的活性，稳定性高，抗逆性强，且生长速度快，解淀粉芽孢杆菌被认为是一种非常理想的生防菌资源。解淀粉芽孢杆菌B4在静置条件下可以形成极为明显的生物被膜，且在分子功能一级类别中，有308个基因被注释到metal ionbinding，因此，在现有的生防能力的基础上，通过外源添加无害金属子提高其生物被膜的形成，从而实现抑制腐败病原菌能力的提升，为采后果实病害生物防治提供一种新的思路。

1.Costerton J W,Stewart P S,Greenberg E P.Bacterial biofilms:a commoncause of persistent infections[J].Science,1999,284(5418):1318-1322.

2.陈云.枯草芽孢杆菌生物膜在青枯病生防中的功能研究及Cyclic-di-GMP信号通路初探[D].南京农业大学,2012.

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过外源添加金属离子提高生防细菌抑制腐败菌的能力及在果实贮藏中的应用方法。该方法在外源无害的前提下，通过向菌悬液中加入金属铁离子，增强了芽孢杆菌生物被膜的形成，提高了芽孢杆菌在培养平板及果实中抑制病原菌的能力，降低了采后果实发病率，为增强菌株生防效用新方法奠定基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明首先提供了一种用于抑制采后果实腐败病原菌的含铁离子菌悬液的制备方法，其包括如下步骤：

(1)将解淀粉芽孢杆菌B4(Bacillus amyloliquefaciens B4)菌株在平板培养基上活化，选取单菌落接种至含有LB液体培养基的试管中，37℃，180-220rpm培养12-16h，得到解淀粉芽孢杆菌种子培养液；

所述解淀粉芽孢杆菌B4(Bacillus amyloliquefaciens B4)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No:13466，保藏日期为2016年12月19日，该菌株记载在申请人早先申请的中国专利申请CN201710100745.9中；