[发明专利]基于细胞旋转主动光操控技术的散斑荧光显微方法和系统

说明书

本发明提供的是一种基于细胞旋转主动光操控技术的散斑荧光显微方法和系统。其特征是：该装置光操控部分由三台激光器组成。一台激光光束完成对细胞的稳定捕获，另一台激光器经过声光调制器产生不同的偏转角度，由显微物镜聚焦交替照射到被捕获细胞两端，实现细胞旋转角度的精准主动光操控。细胞每旋转至不同角度并达到稳定状态后，第三台激光器产生动态散斑，激发照明层面内的荧光团，获取细胞的层析图像，最终重构细胞的三维结构图像。本发明构建的系统可实现活体单细胞高时间和高空间分辨率的三维结构成像，具有结构简单、成本低、易操作、非侵入等特点，在生物学、医学和生命科学等许多研究领域中都具有广阔的应用前景。

(一)技术领域

本发明涉及的是一种基于细胞旋转主动光操控技术的散斑荧光显微方法和系统，可用于活体单细胞的捕获与控制和三维结构的高时间分辨率、高空间分辨率成像，属于生物光镊、生物成像领域。

(二)背景技术

细胞，是生物体的结构和功能的基本单位，也是生命活动的基本单位。细胞能够通过分裂而增殖，是生物体个体发育和系统发育的基础。细胞或是独立的作为生命单位，或是多个细胞组成细胞群体或组织、或器官，系统和整体；细胞是遗传的基本单位，并具有遗传的全能性。除病毒的所有生物，都由细胞构成。

随着对生命活动本质逐渐深入的探索，人们希望通过对细胞内部结构进行更加细致的观察，从而逐步获得对细胞结构和功能更清晰的认识。通过研究细胞可以研制生物药剂和其他生物产品。如应用细胞工程和基因工程技术已可以大量生产纯度很高的蛋白质制剂，有各种抗体、受体、生长因子、细胞因子、血液因子、神经递质，这些产品已商品化，广泛应用于医学诊断和治疗实践。基因组学和蛋白质组学的研究的快速进展，必将促进生物制剂产业更快地发展，取得更大的经济效益。

目前，许多关于细胞的实验都需要在保持细胞活性的条件下进行。保持细胞的生物活性不仅可以观察到只有在活性条件下的特有生物现象，还有助于人们更好的了解细胞的内部结构和运行方式。因此，保持细胞活性具有深远的意义。

在探究人类健康和疾病相关的细胞学基础是观察细胞，因此从时空和分子层面研究感兴趣的细胞十分关键。显微成像是细胞生物学中的一个非常重要的工具，它能够在样本的结构环境中详细研究样本，也可以分析细胞器和大分子。如果想要充分扩展自己的研究成果并获得高质量的数据，选择合适的显微成像方法将十分重要。目前的医学研究对显微镜的分辨率、精度的要求都很高，越是复杂的研究就越需要高性能的实验仪器，近几年，生物成像领域始终使研究的热门，日新月异的新技术使得实验方法也多种多样。

传统的宽场荧光显微镜通过物镜将激发光聚集，同时收集样品的荧光信号成像。通过照明方式可以得出，虽然焦平面上的光最强，但其上下的样品也会被照亮，导致了引入额外的光毒性，影响样品生物活性，甚至造成细胞死亡和成像焦平面以外的干扰信号进入图像，导致图像分辨率和反差降低。激光扫描共聚焦显微镜使用点扫描的方法，通过在探测端引入针孔，滤除了焦平面以外的杂散光，使分辨率，特别是纵向的分辨率得到了提升，能够实现三维成像。但是，当激发光聚焦时，仍然会照亮上下区域。由于使用点扫描方式成像，为达到较快的速度，光束照射每个点的时间很短，成像元件的量子效率又很低，需要更强的激发功率。与传统的宽场荧光显微镜相比，光漂白和光毒性更加严重。双光子激光扫描显微镜可以大大减少光毒性的损害。由于使用近红外激光照明，对活体样品的光毒性大大降低，并且能够穿透更深的样品。但是，双光子的信号很弱，采集速度非常慢，不适合大样品动态成像，而且成本也十分昂贵，限制了其应用范围。

随着成像技术的不断发展，具有深层层析分辨能力，采用宽场的动态散斑显微成像方法得到了广泛的应用。该技术具有成像速度快、具有高时间和高空间分辨率、无需外源标记、结构简单、成本低廉等优点。