[发明专利]基于四芯光纤光操控的动态散斑荧光显微成像方法和系统

说明书

本发明提供的是一种基于四芯光纤光操控的动态散斑荧光显微成像方法和系统。其特征是：该装置光操控部分由一条输出端面加工成特定角度的四芯光纤安装组成。激光光束经分束器分成四束分别经单模光纤耦合进一条四芯光纤，不仅可以在输出端面附近形成贝塞尔光场，稳定捕获待测细胞，还可以通过调节调制器来改变光纤的纤芯的输出功率，使细胞绕特定轴线旋转。细胞每旋转至一定角度并达到稳定状态后，利用动态散斑照明宽场荧光显微技术获取细胞的层析图像，最终重构细胞的三维结构图像。本发明构建的系统具有结构简易、成本低廉、操作简单等特点，在生物学、医学和生命科学等许多研究领域中具有广泛的应用前景。

(一)技术领域

本发明涉及的是一种基于四芯光纤光操控的动态散斑荧光显微成像方法和系统，通过一根四芯光纤稳定捕获并精准操控活体单细胞的旋转角度，实现动态散斑宽场照明的快速扫描，可用于活体单细胞的捕获与控制和三维结构的高时间分辨率、高空间分辨率成像，属于生物光镊、生物成像领域。

(二)背景技术

细胞是组成有机体形态和功能的基本单位，自身又是由许多部分构成的。所以关于细胞结构的研究不仅要知道它是由哪些部分构成的，而且要进一步搞清每个部分的组成。相应地，关于功能不仅要知道细胞作为一个整体的功能，而且要了解各个部分在功能上的相互关系。

有机体的生理功能和一切生命现象都是以细胞为基础表达的。因此，不论对有机体的遗传、发育以及生理机能的了解，还是对于作为医疗基础的病理学、药理学等以及农业的育种等，对单个细胞的观察都至关重要。

怎样保持细胞生理特性的情况下研究细胞是揭示生命奥妙，攻克疾病的关键。通过对活细胞的研究，不仅可以观测到特别的现象，也有助于从细胞层面看待病理特征，这就对细胞活性提出了要求。为了更好的解析细胞表面特性，创造一种保持细胞活性的系统十分关键。

绝大多数细胞都非常微小，超出人的视力极限，观察细胞必须用显微镜。近年来，基于荧光显微成像技术、激光扫描共焦显微镜结构光照明成像技术已经成为研究细胞的重要工具。

使用透射式电子显微镜(Transmission Electron Microscope，TEM)在真空中观察经固定、脱水处理的细胞精细切片，获得细胞内部的高分辨精细结构图像。单细胞质谱分析技术(Mass Spectrometry，MS)和质谱流式细胞分析技术 (Mass Cytometry，MC)利用金属同位素对细胞进行标记，通过质谱分析方法实现单细胞成分的快速检测和定量分析。但是上述分析方法均无法实现活细胞的成分分析，因此无法准确揭示生物分子在细胞的生命周期中的功能和作用。

近年来，基于荧光标记技术的荧光光谱分析和显微成像技术已经成为单细胞研究的重要工具。流式细胞分析技术(Flow CytoMetry，FCM)是一种用于对荧光标记的大量细胞进行高速定量分析和筛选的细胞分析技术。通过对大量细胞进行测量，可以得到一个细胞群体很好的统计分析结果，但是无法区分待测样品中少量的特异性细胞个体，无法实现单一特异性细胞的物理化学特性的深入分析和研究。

荧光显微成像技术利用生物体的自体荧光或引入外源荧光标记提供化学特异性和成像对比度，是目前单细胞分析与成像的主要研究手段，具有高特异性，高时间和高空间分辨率，以及三维层析成像能力。但是外源荧光标记必然会影响细胞的自身性质和生命活动过程，甚至会产生光致毒性，荧光团自身的光致漂白都是荧光显微成像技术无法回避的问题。

具有层析分辨能力光学显微镜的出现对显微镜成像技术的发展具有划时代的意义，该技术的实现使得组织和细胞的光学连续切片和三维结构重建能够得以实现，对研究细胞各种现象提供了重要的工具。激光扫描共焦荧光显微镜与普通的宽场荧光显微成像方法相比，它的优点在于能够获得一定厚度样品的三维层析图像，可提供较高的时间和空间分辨率。但是这种显微成像方法需要对一个或多个照明点进行扫描，需要三维扫描系统，从而使得改显微镜成像速度慢、系统复杂、造价昂贵。