[发明专利]羰基还原酶突变体及其不对称合成双手性化合物的应用

权利要求书

1.一种羰基还原酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.1所示野生型羰基还原酶氨基酸序列第100位进行单突变获得的。

2.如权利要求1所述羰基还原酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第100位丙氨酸突变为丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸中的一种。

3.一种权利要求1所述羰基还原酶突变体编码基因构建的基因工程菌。

4.一种权利要求1所述羰基还原酶突变体在不对称还原脂肪族酮化合物合成双手性化合物中的应用，其特征在于所述脂肪族酮化合物为6-氰基-(5R)-3-羰基己酸叔丁酯、4-氯乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸乙酯、4,4,4-三氟乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸叔丁酯、乙酰丙酸乙酯、异丁酰乙酸甲酯、异丁酰乙酸乙酯、4-氯-乙酰乙酸甲酯、丁酰乙酸乙酯。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为：分别将羰基还原酶突变体基因工程菌和葡萄糖脱氢酶基因工程菌经发酵培养后的发酵液离心收集的湿菌体混合，以混合菌体为催化剂，以脂肪族酮化合物为底物，以葡萄糖为辅助底物，以pH 7.0-8.0缓冲液为反应介质构成转化体系，在35～40℃、600～800rpm条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得手性化合物；所述葡萄糖脱氢酶基因工程菌是将SEQ ID NO.6所示葡萄糖脱氢酶EsGDH基因插入到pET28a(+)的Nco I、Xho I位点，构建重组表达载体，并将此表达载体转入E.coli BL21(DE3)，制得基因工程菌E coli BL21(DE3)/pET28b(+)-esgdh。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述催化剂加入量以缓冲液体积计0.1-20g/L，混合菌体中羰基还原酶突变体基因工程菌经发酵培养后的发酵液离心收集湿菌体与葡萄糖脱氢酶基因工程菌经发酵培养后的发酵液离心收集湿菌体以湿重比1-5:1混合；所述底物加入量以缓冲液体积计1-150g/L；所述葡萄糖加入量以缓冲液体积计1-150g/L。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述羰基还原酶突变体基因工程菌经发酵培养的湿菌体按如下方法制备：将羰基还原酶突变体基因工程菌接种到终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12～16h，获得种子液；将种子液以体积浓度2.0％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养2h，培养液中加入终浓度为0.15-0.2mM异丙基硫代半乳糖苷，28℃培养12～14h后，4℃、8000rpm离心10min，获得含羰基还原酶突变体的湿菌体。

8.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为：将羰基还原酶突变体基因工程菌经发酵培养后的发酵液离心，收集湿菌体，以湿菌体破碎提取的纯酶液为催化剂，以NADPH为辅酶，以脂肪族酮化合物为底物，以pH 7.0-8.0缓冲液为反应介质构成转化体系，在35～40℃、600～800rpm条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得手性化合物。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述底物添加终浓度以缓冲液体积计为1-50mM；辅酶加入终浓度以缓冲液体积计为0.5-5mM；所述催化剂加入终浓度以缓冲液体积计为0.1-20g/L。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述羰基还原酶突变体基因工程菌经发酵培养的湿菌体提取的纯酶液按如下方法制备：

(1)粗酶液：将羰基还原酶突变体基因工程菌经发酵培养的湿菌体用100mM PB缓冲液重悬，置于冰上超声破碎10min；超声破碎条件：功率设定为400W，破碎1s暂停5s；并在4℃下，以12000rpm离心10～15min，上清用0.22μm的滤膜过滤，滤液即为粗酶液；

(3)纯酶液：

结合液组成：20mM二水合磷酸二氢钠、300mM氯化钠，溶剂为超纯水，用磷酸或氢氧化钠调节pH至7.0；

洗涤液组成：20mM二水合磷酸二氢钠、300mM氯化钠和50mM咪唑，溶剂是超纯水，用磷酸或氢氧化钠调节pH至7.0；

洗脱液组成：20mM二水合磷酸二氢钠、300mM氯化钠和500mM咪唑，溶剂为超纯水，用磷酸或氢氧化钠调节pH至7.0；

用结合液冲洗镍柱，流速为0.4mL/min，直到UV基线平衡后，将粗酶液以0.2mL/min的流速上样，使目的蛋白和镍柱充分结合；用洗涤液冲洗杂蛋白，流速为0.3mL/min，将杂蛋白冲洗干净，直到UV基线平衡；用洗脱液洗脱目的蛋白，流速为0.25mL/min，当UV达到200mAU时开始收集，当UV再次降至200mAU时停止收集，获得目的蛋白洗脱液；将收集的目的蛋白洗脱液置于20mM的pH 7.0磷酸钾缓冲液中透析过夜，截留液即为纯酶液。