[发明专利]基于RAA扩增和CRISPR-Cas12a的新型冠状病毒ORF1ab基因检测方法

说明书

本发明提供了一种crRNA分子及用于CRISPR‑Cas12a检测SARS‑CoV‑2核酸的方法。本发明提供的方法简便、易行、快速，当结合重组酶聚合酶核酸扩增技术时，检测SARS‑CoV‑2的ORF1ab基因灵敏度为1000拷贝/mL，显示出了极高的灵敏度。在实际应用中，检测灵敏度为96.00％，特异度为100.00％，阳性预测值为100.00％，阴性预测值为96.15％，可有效检测新冠病毒核酸样本。本方法仅需要提供37℃‑42℃即可完成全部反应，通过简单的荧光读取设备即可判读结果，适合仪器条件较为简单的卫生机构或疫情现场开展使用。

技术领域

本发明涉及一种病毒核酸的检测方法，属于微生物检测应用领域。

背景技术

新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2， SARS-CoV-2)是单股正链RNA病毒，其功能性编码基因包括开放阅读框1ab 基因(Open ReadingFrame 1ab，ORF1ab)、刺突蛋白基因(Spike protein，S)、 包膜蛋白基因(Envelopeprotein，E)、膜蛋白基因(Membrane，M)和核蛋 白基因(Nucleocapsid，N)。新型冠状病毒感染人体后可造成新型冠状病毒肺 炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)，患者出现发热、咳嗽、胸闷、乏 力等流感样症状，严重者可出现呼吸困难、急性呼吸窘迫综合征甚至死亡。新 型冠状肺炎的传染源为新冠病毒感染者，通过呼吸道飞沫，直接接触新冠病毒 污染物，粪口途径等多种途径在人群中迅速传播，所有人群均易感。目前，新 型冠状病毒的检测和确诊方法有：核酸检测法、免疫学检测方法和病毒分离培 养，其中核酸检测是认可度最高的检测方法。

CRISPR-Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated gene)全称为“簇状、规律间隔的、短回文重复序列”， 该系统首先在大肠杆菌中被发现。随着对CRISPR-Cas系统作用机制和Cas蛋 白功能的逐步揭示，研究人员发现该系统具有强大和广泛的应用潜力，如：作 为基因编辑工具，调节基因表达，用于核酸检测和诊断，核酸成像技术，对细 菌进行快速分子分型等。新发现的Cas12a系统可用于核酸检测，实现病原体 的快速诊断。CRISPR-Cas12a系统用于核酸检测的原理为：Cas12a蛋白首先 与相应的crRNA结合形成Cas12a-crRNA复合体，随后识别目标DNA处前间 隔序列邻近基序(Protospacer-Adjacent Motif，PAM)，crRNA与DNA双链中 的目标链互补结合形成R环，DNA双链解螺旋，RuvC核酸内切酶催化位点 构象激活，由于该核酸内切酶位点每次只能嵌入一条DNA链，因此目标DNA 双链依次断裂，首先剪切非目标链，随后剪切目标链。切割产物从复合上释放 出去后，Cas12a蛋白的RuvC核酸内切酶催化位点保持激活状态，可随机剪切 降解任意单链DNA。基于该原理，将单链DNA制备成荧光淬灭探针，通过监 测荧光信号的释放实现对目的序列的特异性检测。然而，使用单一的 CRISPR-Cas核酸检测的灵敏度非常有限，通常将核酸扩增技术与该检测技术 联合应用，可大幅度提高检测的灵敏度。

常用的核酸扩增方法有：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction， PCR),重组酶聚合酶核酸扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA 或Recombinase-aid Amplification，RAA)，环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)，滚环扩增(Rolling Circle Amplification，RCA) 等。其中RAA可在较低温度下(37～42℃)，短时间内完成核酸扩增反应，具 有操作简便、快速、灵敏度高和特异性强的特点，在病原的快速检测领域有很 大的应用潜力。