[发明专利]一种鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光菌株及构建方法

权利要求书

1.一种鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光菌株，其特征在于：所述的该鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光菌株分类命名为Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心；保藏号为CGMCC No. 22723；保藏时间为2021年6月16日。

2.根据权利要求1所述的一种鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光菌株，其特征在于：所述的鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光菌株，采用基因工程法构建，其具体构建步骤如下：

1、目的基因PagC启动子的扩增和纯化；

以长江大学动物科学实验室保存的鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028为模板，用上海生物工程有限公司合成的引物PagC-F1、PagC-R2扩增PagC基因启动子，引物序列分别为：CGT GCGCAG TTA ACC ACT CTT AAT AAT AAT G，GCT CTA GAT ACT ACT TAT TAT TTA CGG TGT，该引物由长江大学动物科学实验室提供；PCR扩增反应体系50μL，反应组分为10×buffer 5μL，dNTP 5μL， PagC-F1 1.25μL， PagC-R2 1.25μL，鼠伤寒沙门氏菌菌液0.25μL，rTaq酶0.5μL，ddH₂O 35.75μL，其中Taq酶和dNTP购自上海宝生物有限公司；扩增程序为95℃ 4min；95℃ 30s，57℃ 30s，72℃30s，39循环；72℃ 4min；

PCR结束后取50μL PCR产物，配置1.5％琼脂糖凝胶，6×Loading Buffer与PCR反应液充分混匀上样，凝胶成像仪确认条带位置，紫外仪上切取716bp的目的基因片段；凝胶回收试剂盒回收PagC启动子目的片段；最终得到纯化后的PagC基因启动子片段；

2、 pMD18T-PagC质粒的构建

（1）将纯化后的PagC基因启动子片段连接到pMD18-T载体上，连接体系为pMD18-T 1μL，PagCDNA 1μL，ddH₂O 2μL，SolutionⅠ5μL，其中pMD18-T载体和SolutionⅠ购自上海宝生物有限公司；连接体系置恒温金属浴上16℃反应30min，得到pMD18T-PagC连接产物；

（2）制备E. coliDH5α大肠杆菌感受态；

无菌接种环取长江大学动物科学实验室冻存的E. coliDH5α大肠杆菌于LB琼脂平板划线，37℃培养箱培养，第二天挑取单菌落于3mL LB液体培养基37℃，200 r/min摇床过夜培养；将过夜培养液按1:100接种50 mL LB液体培养基，37℃ 200 r/min培养使细菌分光光度值OD600达0.6，培养3h得到菌液；菌液冰上预冷30min，分装到预冷的1.5mL离心管中，使培养物冷却至0℃；4℃ 3500r/min离心10min，弃上清；用预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬菌体，冰上放置30min，4℃ 3500r/min离心10min，弃上清；加入50μL预冷含15％甘油的0.1mol/LCaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，即成感受态细胞悬液；

（3）将pMD18T-PagC连接产物用CaCl₂转化法转入E. coliDH5α感受态细胞中，构建pMD18T-PagC大肠杆菌菌株，提取阳性克隆子质粒，具体步骤如下：

pMD18T-PagC连接产物10μL加入50μLE. coliDH5α大肠杆菌感受态感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，冰上放置2～3min；加入100μL LB液体培养基，37℃，180rpm/min 复苏1h；将160μL转化菌液涂至含50µg/mL氨苄的LB平板，37℃过夜培养；挑取单菌落进行PCR鉴定；PCR反应体系为10×buffer 2μL，dNTP 2μL，PagC-F1 0.5μL，PagC-R2 0.5μL，疑似含pMD18T-PagC的E. coli DH5α菌液0.1μL，rTaq酶0.2μL，ddH₂O 14.7μL；PCR程序为95℃4min；95℃ 30s，57℃ 30s，72℃30s，39循环；72℃ 4min；最终鉴定出4个阳性克隆菌株；阳性菌落扩大培养后使用小量提取试剂盒提取质粒，命名为pMD8T-PagC重组质粒；

3、PagC-EGFP质粒的构建

（1）接种环取购自丰晖生物有限公司的pET28a-EGFP菌株接种于含30µg/mL卡那霉素的平板，37℃恒温培养箱过夜培养；

第二天挑取单菌落于3mL含30µg/mL卡那霉素的LB培养液37℃、200 r/min摇床过夜培养；将过夜培养液按1:100接种50 mL含30µg/mL卡那霉素的LB培养液，37℃ 200 r/min过夜培养，使用小量质粒提取试剂盒提取pET28a-EGFP质粒；

（2）分别用XbaⅠ、FspⅠ限制性内切酶对pET28a-EGFP质粒和pMD18T-PagC重组质粒进行酶切；酶切体系为质粒DNA 2μg，FspⅠ 0.4μL，XbaⅠ 0.2μL，10× Buffer 0.6μL，ddH₂O 0.8μL，37℃孵育2h；将pET28a-EGFP质粒和pMD18T-PagC重组质粒经XbaⅠ、FspⅠ酶切的产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分离；凝胶回收试剂盒分别回收约716bp的PagC片段和4184bp的pET28a-EGFP片段；最终得到了纯化的PagC片段和pET28a-EGFP片段；

（3）将PagC片段与pET28a-EGFP片段以3:1摩尔比混合，加入T4DNA连接酶，16℃连接12h；连接体系为pET28a-EGFP片段0.5μg，PagC片段0.5μg，10×Buffer 1μL，T4连接酶1μL，ddH₂O 2μL，其中T4连接酶购自NEB公司；连接产物用CaCl₂转化法转化大肠杆菌，冰浴30min，42℃热激90s，冰上急冷2～3min；加入100μL LB液体培养基中，37℃，180rpm/min 培养2h；

将160μL转化菌液涂至含30µg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培养16小时；

（4）挑取卡那霉素平板上的单菌落进行菌液PCR鉴定；

将疑似阳性的单菌落进一步扩大培养提取质粒进行质粒PCR鉴定，PCR体系为10×buffer 2μL，DNTP 2μL， PagC-F1 0.5μL， PagC-R2 0.5μL，疑似含PagC-EGFP的阳性克隆菌液0.1μL，rTaq酶0.2μL，ddH₂O 14.7μL；PCR程序为95℃ 4min；95℃ 30s，57℃ 30s，72℃30s，39循环；72℃ 4min；PCR反应阳性菌液抽提质粒后，采用FspⅠ和XbaⅠ酶切再次鉴定，酶切体系为质粒DNA 1μg，FspⅠ 0.4μL，XbaⅠ 0.2μL，10×Buffer 0.6μL，ddH₂O 0.1μL，37℃孵育3h，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳；将阳性菌株进行测序，测序引物为5'-GCTGCCCATGGTATATCTCCT-3'；将鉴定的重组质粒命名为PagC-EGFP；

4、Sal14028-EGFP菌株的构建

（1）鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028感受态细胞的制备；

以无菌接种环取长江大学动物科学实验室冻存的鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028于LB琼脂平板划线，37℃培养箱培养，第2天挑取单菌落于3mL LB液体培养基；37℃，200 r/min摇床过夜培养；将过夜培养液按1:100接种50 mL LB液体培养基，37℃ 200 r/min培养使细菌分光光度值OD600达0.3～0.4，一般需2.5-3h；4℃条件下4000 r/min离心15 min，弃上清，用预冷的50mL去离子水重悬菌体；去离子水重悬并离心2次，去离子水体积分别为25、12.5mL；用预冷的50mL 10%甘油重悬菌体后4000 r/min离心15 min；10%甘油重悬并离心4次，10%甘油体积分别为50、25、12.5、0.25mL；悬浮的感受态细胞按40 µL/管分装，制得鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028感受态细胞；

（2）鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028感受态细胞的转化与鉴定；

加0.5μg PagC-EGFP质粒于40μL鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028感受态细胞中，混合后放冰上预冷30min；设置一个不含DNA样品的阴性对照；设置电转仪参数：电压2.0KV，时间4ms，电容25μF和脉冲电阻200Ω；将冷却的混合物加入预冷的电转杯中，擦净杯外的水份并进行电转；取出电转产物到1.5mL EP管，立刻加入200μL LB液体培养基于37℃摇床复苏1h；复苏产物全部涂布于含30μg/mL卡那霉素抗性的LB平板，37℃培养16h；挑取单个菌落于30μg/mL卡那霉素抗性LB液体培养基扩增培养，荧光显微镜观察；荧光阳性菌株标记为Sal14028-EGFP。