[发明专利]小反刍兽疫病毒强毒反向遗传系统及动物感染模型

说明书

本发明涉及一种小反刍兽疫强毒的反向遗传系统，一种小反刍兽疫病毒(PPRV)的重组拯救病毒(rPPRV)(还有一种表达GFP的示踪重组小反刍兽疫强毒)。以及一种rPPRV动物感染模型，采用重组拯救病毒rPPRV对反刍兽进行攻毒。通过联合采用滴鼻和皮下注射两种途径对反刍兽进行攻毒，成功获得了小反刍兽疫的动物感染模型，为小反刍兽疫的疫苗研制、致病机制等研究奠定了基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及小反刍兽疫强毒的反向遗传系统及小反刍兽疫病毒感染的动物模型的建立。

背景技术

小反刍兽疫(Peste des Petits Ruminants，PPR)是一种由PPR病毒(PPRV)引起的急性、高度接触性传染病。PPR主要感染小反刍兽，如绵羊和山羊，其中山羊比绵羊更容易感染该疾病，新生和幼小动物比成年动物更易受到影响。因此疫苗的使用不可或缺，尤其是新型DIVA疫苗的开发将对我国 PPR的消灭具有重要意义。然而，小反刍兽疫疫苗研制离不开有效性评价，目前我国小反刍兽疫不管是目前正在全国范围内使用的Nigeria75/1弱毒苗(HAMMOUCHI et al.,2012)，还是正在研究的重组山羊痘病毒载体苗，其攻毒保护评价都在国外完成(哈萨克斯坦和摩洛哥)，因此PPRV的动物感染模型是制约我国小反刍兽疫疫苗研制的重大瓶颈。

这主要是由于小反刍兽疫病毒基因组全长15954bp，在麻疹病毒属中最长，很难获得真实cDNA序列。序列的完整性和真实性是构建感染性克隆的先决条件，如果人为的引入某些碱基突变，将使病毒cDNA的感染性受到影响，甚至丧失感染性(BOYER and HAENNI,1994)。随着片段长度的增加，在PCR以及构建质粒的过程中发生突变的几率也在增加，获得真实全长cDNA和辅助质粒的几率也在降低。

为了构建我国自主的PPRV的动物感染模型，保证获得PPRV的cDNA的真实性，本发明采用黑龙江株(PPRV/CN/HLJ/13)及依据该流行株在体外拯救的rPPRV/CN/HLJ/13病毒，对山羊进行攻毒，构建rPPRV动物感染模型。

发明内容

首先，本发明提供一种小反刍兽疫病毒(PPRV)的重组拯救病毒(rPPRV)。进一步，本发明优选提供小反刍兽疫黑龙江株PPRV/CN/HLJ13株(以下简写为PPRV/CN/HLJ/13) 拯救的重组拯救病毒rPPRV/CN/HLJ/13和rPPRV/CN/HLJ/13/GFP。

根据对PPRV序列的测序，设计并合成了特定的PCR扩增引物及鉴定引物，扩增了多个可以覆盖全长基因的重叠片段，并分别连接到相应载体中去，将各片段扩增后依次连接成全长cDNA，得到感染性克隆质粒pCN13，并在此基础上设计引物在N和P之间插入GFP 表达框架，获得感染性克隆质粒pCN13-GFP。为了保证感染性克隆中全长cDNA在其转录时5’和3’端准确和完整，分别在5’和3’端两端分别引入锤头状核酶序列和丁肝核酶(HDV) 序列。将感染性克隆质粒pCN13和pCN13-GFP分别和辅助质粒pCI-N共转染Vero-gSLAM 细胞，待细胞出现CPE和荧光时，收获病毒悬液，冻于-70℃保存。将救获病毒分别命名为 rPPRV/CN/HLJ/13和rPPRV/CN/HLJ/13/GFP。

其次，本发明提供一种小反刍兽疫病毒(PPRV)的重组拯救方法，所述方法包括如下步骤：

(1)、PPRV病毒基因组全长cDNA克隆pCN13的构建，根据对PPRV序列的测序，将PPRV CN/HLJ/13序列分成互相重叠的多个部分，设计并合成特定的PCR扩增引物及鉴定引物，以使扩增的多个重叠片段的目的基因可以覆盖PPRV全长基因，将各段目的基因克隆至载体上构建出相应的中间质粒，然后根据特定的引物将相应中间质粒扩增克隆到PCI载体上，经酶切后构建出PPRV CN/HLJ/13株全长cDNA质粒pCN13；

(2)、表达GFP基因的PPRV病毒基因组全长cDNA克隆pCN13GFP的构建，将GFP 基因克隆至处理好的纯化的线性化的pCN13中，获得pCN13-GFP质粒。