[发明专利]检测巴氏奶致病菌的多重PCR引物及其鲁棒性检测方法

说明书

检测巴氏奶致病菌的多重PCR引物及其鲁棒性检测方法，包括针对阪崎肠杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌三种致病菌各选择了四种特异性基因，并针对所选基因设计了四套引物。检测方法包括DNA模板的制备、建立四套多重PCR反应体系和反应程序、PCR产物鉴定及结果观察。本发明设计了四套引物、四套PCR反应体系和反应程序来提高检测方法的准确性，避免了假阴性；同时，在保证灵敏度不变的情况下对退火温度进行范围确定，避免了由于PCR仪温度控制精度降低以及老化问题而影响目标DNA的扩增及检测产生的不稳定、不准确的问题。同源性对比均超过99.06%；具有高度特异性；灵敏度可达到10 CFU/mL；与国标方法比较具有更高的时效性。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及检测巴氏奶致病菌的多重PCR引物及其鲁棒性检测方法。

背景技术

巴氏奶是乳制品中的一种，由于巴氏奶杀菌条件温和，能够最大限度地保留原料奶中的营养物质和风 味，深受消费者欢迎。据调查，全球80％的国家以消费巴氏奶为主，其中奶业发达国家如美国、日本、新 西兰等国巴氏奶的消费量占液态奶消费量的80％以上。但是温和的杀菌方式及产品生产过程中的卫生污染 会导致一些致病菌仍可能残留在最终的产品中。阪崎肠杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌是影响乳制品安全常见 的致病菌。据统计，50-80％的阪崎肠杆菌感染发生在乳制品中。大肠杆菌是自然界中存在最广的细菌， 被认为是乳品污染的重要指标，感染剂量为10CFU/g。沙门氏菌感染严重，全世界报告的80％人类食源 性疾病感染都是由沙门氏菌引起的。我国巴氏奶中致病菌的检测方法参照GB 19645-2010，整个过程包括 前增菌、选择性增菌、平板分离、血清型实验、生化实验，该方法检测时长需要5-7天，而巴氏奶的保质 期一般只有3-7天。

多重PCR技术具有分析时间短、灵敏度低、特异性和自动化潜力高等优点，且一次反应便可同时检 测多种致病菌。多重PCR技术以其本身的优势使得该技术在多种领域中都有所研究，如食品中乳制品、水 果等检测；疾病中牛乳房炎、呼吸道疾病的检测；农业中蚜虫、转基因成分的检测。但是目前方法就多重 PCR的实际应用上还存在一些局限性：以往研究中，对于一种致病菌，仅选择一种该致病菌的特异性基因 设计引物，但是却忽略了被检测的致病菌如果出现基因缺失或者基因变异，会导致所建立的检测方法无法 对该致病菌进行有效识别检测，造成假阴性结果的出现。

另一方面，多重PCR方法对退火温度要求高，以往的方法在对退火温度选择时，仅仅根据电泳图谱 选择一个最优的退火温度值，但是却忽略了PCR仪温控不准确或者其老化问题，导致控温精度下降，使得 设置的退火温度和实际仪器温度有出入，影响了该检测方法的准确性。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种检测巴氏奶致病菌的多重PCR引物，对于被检测的三 种菌各选择了四种特异性基因并设计了四套引物来提高检测方法的准确性，从而避免假阴性结果。同时， 发明的另一个目的是提供一种基于上述多重PCR引物的巴氏奶致病菌的鲁棒性检测方法，本方法对多重 PCR的退火温度进行范围确定，在保证该方法灵敏度不变的情况下，对所建立的方法进行温度稳定性验证， 提高多重PCR方法的实际应用性。

本发明通过以下技术方案实现：

检测巴氏奶致病菌的多重PCR引物，其特征在于针对阪崎肠杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌均选择四种特 异性基因：

阪崎肠杆菌的gyrB基因、grxB基因、ITS基因和CgcA基因；

大肠杆菌的uidA基因、dnaE基因、rfbE基因和phoA基因；

沙门氏菌的mgtC基因、orgC基因、invA基因和FLIC基因；

针对上述基因设计了四套引物，序列为：

第一套特异性引物：

阪崎肠杆菌gyrB基因的上下游引物：