[发明专利]一种插入miRNA互补序列的多组织限制型柯萨奇B组III型病毒及其应用

说明书

本发明涉及一种插入miRNA互补序列的多组织限制型柯萨奇B组III型病毒及其应用。所述的miRNA包括：miR‑206，miRNA‑29a‑3p，miRNA‑124‑3p。所述的应用指所述的多组织限制型柯萨奇B组III型病毒能够用于制备心脏，胰腺和脑组织限制型疫苗。

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及一种插入miRNA互补序列的多组织限制型柯萨奇B组III型病毒及其应用。

背景技术

柯萨奇B组病毒(CVB)一直被确定为是造成严重急、慢性心肌炎、胰腺炎、脑炎等相关疾病的主要致病原，其中柯萨奇B组III型病毒(CVB3)是常见的致病病原微生物。病毒在靶器官处的大量复制会直接裂解细胞，同时还会造成受损部位严重的免疫炎性损伤，比如活化的T细胞通过细胞介导的细胞毒作用会摧毁病毒感染的细胞，细胞因子在病变部位的产生、趋化和浸润会加重对靶器官的损伤。因此，有效抑制病毒在靶器官的复制是降低CVB3对机体损害的重要途径。

针对病毒感染性疾病，疫苗被认为是抵御病毒性疾病最成功的方法之一，尤其是减毒活疫苗有着较好的诱发机体产生抗病毒免疫反应的效果。然而还有许多针对病毒感染的疫苗在研制过程中未能在临床使用，包括预防病毒性心肌炎的柯萨奇B3病毒疫苗，由于基因组在传代过程中的不稳定性以及CVB有持续性感染的特性，导致了存在病毒对心肌损伤的长期风险，因此阻碍了该疫苗的使用，目前最大的问题是缺乏稳定有效降低致病性的减毒方法或途径。疫苗毒力回复问题在已应用的疫苗中也存在，已有报道有些减毒活疫苗在接种人体后可能会发生回变，恢复病毒在感染受累器官组织中的致病表型，由此产生疫苗相关病。因此合理调控病毒疫苗进入体内组织分布和降低对重要器官致病性是亟待解决的关键问题。

近几年，有多项研究利用miRNA具有组织特异性分布、在转录后水平调控基因表达的特点对病毒基因组进行改造，以实现限制病毒在特定组织中复制的目的。将特异性miRNA互补序列导入病毒基因组，可以限制病毒在重要靶器官复制，同时不改变病毒在其他器官中的复制能力。通过这种方法改造病毒亲嗜性的研究可行性已在神经毒性黄病毒，脊髓灰质炎病毒、水泡性口炎病毒、CVA21等病毒上得到证实。

在前期的研究中我们以CVB3感染性克隆为载体，在CVB3全长基因组的5’UTR插入心肌特异性miRNA133和miRNA206的互补序列，获得心肌限制型CVB3。当以相同滴度的病毒(0.01LD50)感染小鼠后，心肌限制型CVB3组小鼠心肌部位的病毒滴度较野生CVB3病毒组明显降低，降低100倍，心肌部位的病理损伤程度和小鼠的病死率也明显降低，实现了对心肌组织的定向减毒。但病毒性心肌炎患者除心肌组织受损外，CVB3感染还可造成病毒在胰腺，脑组织等部位的大量复制，导致胰腺炎，脑膜炎，严重损害机体。我们前期也发现心肌限制型CVB3感染小鼠后，心脏部位的病毒滴度较对照组明显降低，但胰腺处仍有病毒大量复制，这表明我们构建的心肌限制型CVB3仍存在局限性。

发明内容

本发明首先涉及一种插入miRNA互补序列的多组织限制型柯萨奇B组III型病毒(CVB-miRT*3)，所述的miRNA包括：miR-206，miRNA-29a-3p，miRNA-124-3p。

所述的互补序列分别为：

miR-206：5’CCACACACTTCCTTACATTCCA3’；

miR-29a-3p：5’TAACCGATTTCAGATGGTGCTA3’；

miR-124-3p：5’GGCATTCACCGCGTGCCTTA 3’。

优选的，所述的CVB-miRT*3中的插入序列如SEQ ID NO.1所示：

5’-CCACACACTTCCTTACATTCCACGATTAACCGATTTCAGATGGTGCTAACCGGTGGCATTCACCGCGTGCCTTAATACAGCAAA-3’