[发明专利]鸟氨酸环化脱氨酶突变体及其应用

权利要求书

1.鸟氨酸环化脱氨酶突变体，其特征在于，所述突变体包含鸟氨酸环化脱氨酶第369位氨基酸由I到E、L、F、A或K的突变；

其中，鸟氨酸环化脱氨酶在NCBI上的参考序列编号为WP_003862260.1。

2.编码权利要求1所述鸟氨酸环化脱氨酶突变体的核酸分子。

3.含有权利要求2所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。

4.权利要求2所述核酸分子或权利要求3所述生物材料的以下任一应用：

(1)用于脯氨酸或以脯氨酸为前体的脯氨酸衍生物的发酵生产；

(2)用于提高脯氨酸或以脯氨酸为前体的脯氨酸衍生物的发酵产量；

(3)用于构建产脯氨酸或以脯氨酸为前体的脯氨酸衍生物的基因工程菌；

优选地，所述以脯氨酸为前体的脯氨酸衍生物选自羟脯氨酸、乙酰脯氨酸。

5.脯氨酸或以脯氨酸为前体的脯氨酸衍生物的生产菌株的构建方法，其特征在于，利用基因工程手段，在具有脯氨酸生产能力的细菌基因组中引入突变，使其编码的鸟氨酸环化脱氨酶包含I369E、I369L、I369F、I369A或I369K突变位点；其中，鸟氨酸环化脱氨酶在NCBI上的参考序列编号为WP_003862260.1；

优选地，所述细菌为埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)菌种；

所述以脯氨酸为前体的脯氨酸衍生物选自羟脯氨酸、乙酰脯氨酸。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细菌为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌为菌株MHZ-0701。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当突变位点为I369E时，所述方法包括以下步骤：

A、利用Phusion超保真聚合酶，以谷氨酸棒状杆菌MHZ-0701的基因组为模板，以PQ389-UP-1F和PQ390-UP-1R为引物，通过PCR扩增得到重组片段UP；以PQ391-DN-2F和PQ392-DN-2R为引物，通过PCR扩增得到重组片段DN；然后以UP、DN为模板，以PQ389-UP-1F和PQ392-DN-2R为引物，通过PCR扩增得到同源重组片段；

B、将所得同源重组片段用酶EcoRI和SalI进行消化，同时将质粒pK18-mobsacB用酶EcoRI和SalI进行消化，并用T4DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒命名为pK18-ocd^I369E，然后将pK18-ocd^I369E转入谷氨酸棒状杆菌MHZ-0701中，筛选阳性转化子；

所用引物序列如下：

PQ389-UP-1F：5′-ccgGAATTCTTTGCAACATGGGCGTTGGA-3′

PQ390-UP-1R：5′-TCCCACAGGTTCAATGTGGTGCCTTCGCCTTTTTCCAGGGCGTTTTCATAC-3′

PQ391-DN-2F：5′-GTATGAAAACGCCCTGGAAAAAGGCGAAGGCACCACATTGAACCTGTGGGA-3′

PQ392-DN-2R：5′-acgcGTCGACGTTTCGATTGCACTGAACACT-3′。

9.根据权利要求5-8任一项所述方法构建得到的脯氨酸或以脯氨酸为前体的脯氨酸衍生物的生产菌株。

10.权利要求9所述生产菌株在脯氨酸或以脯氨酸为前体的脯氨酸衍生物的发酵生产或提高脯氨酸或以脯氨酸为前体的脯氨酸衍生物的发酵产量中的应用。