[发明专利]PRKRA基因作为靶点在抑制小反刍兽疫病毒复制中的应用

说明书

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种PRKRA基因作为靶点在抑制小反刍兽疫病毒复制中的应用。本发明首先发现通过抑制或沉默宿主PRKRA基因，能够抑制小反刍兽疫病毒的复制，可作为靶点用于制备抑制小反刍兽疫病毒复制的药物；其次，以PRKRA基因为靶点，本发明设计了小干扰RNA，所述小干扰RNA能够干扰小反刍兽疫病毒复制，可用于制备抑制小反刍兽疫病毒的复制的药物；并且，本发明提供了一种特异性靶向PRKRA基因的sgRNA，所述的sgRNA能够特异性靶向PRKRA基因，结合CRISPR‑Cas9技术实现了PRKRA基因的完全敲除，获得的单克隆细胞系PRKRA‑KOs对PPRV具有抗性表型，能够显著抑制PPRV在细胞内的复制，为进一步研究PRKRA基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供研究工具和材料。

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种PRKRA基因作为靶点在抑制小反刍兽疫病毒复制中的应用。

背景技术

小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)，属于单股负链且不分节段的RNA病毒，主要感染山羊、绵羊等小反刍动物。PPRV主要侵害淋巴组织和消化道、呼吸道上皮细胞，临床上主要表现为急性发热、肠炎、支气管肺炎和怀孕母羊流产等症状，对我国乃至全球发展中国家的畜牧养殖业造成巨大的经济损失。目前，免疫接种疫苗是抵御小反刍兽疫最有效的方法。与灭活疫苗相比，弱毒疫苗(Nigeria 75/1和Sungri 96)的免疫效果更好、持续时间更长。但从病原学、致病机理等方面的研究并未有很大的突破。因此深入了解宿主蛋白抑制PPRV复制的机制，通过CRISPR-Cas9技术构建抑制PPRV病毒复制的细胞系对于小反刍兽疫疫苗的生产意义重大。

RNA干扰技术的出现对选择毒性提出了可能，为抗病毒研究提供了新思路。RNA干扰是RNA序列特异性转录后基因沉默现象。与以往抗病毒治疗的手段相比，RNA干扰介导的抗病毒效应具有高度的特异性，对非同源基因表达几乎没有影响，因此可将不良反应降到最小；RNA干扰能高效抑制病毒复制，少量的siRNA就可达到降低病毒表达产物的作用；RNA干扰可以针对病毒基因组保守区域发挥作用，从而在一定程度上限制了病毒产生逃避突变株的能力。因此，设计合成靶向小反刍兽疫病毒基因组的siRNAs将可能成为抑制小反刍兽疫病毒感染的有效途径。

PRKRA(interferon-inducible double-stranded RNA-dependent proteinkinase activator A)是细胞内一种不依赖于ds RNA的PKR激活蛋白。之前的研究表明在细胞没有收到病毒感染或者ds RNA刺激的情况下，PRKRA或称PACT(PKR-activatingprotein)仍可以激活PKR，从而导致其下游分子eIF2α的磷酸化，从而抑制宿主细胞翻译功能最终导致细胞发生凋亡。正常情况下，PRKRA与PKR一样广泛存在于各个组织和细胞中，且保持较低的水平，当细胞受到环境刺激变化时，其表达水平会显著提高。PRKRA在哺乳动物发育过程中起到重要的生理作用，且参与细胞生长和肿瘤的发生过程，同时PRKRA还能与Rb蛋白相互作用来改变细胞周期的进程从而调控细胞生长状况。PRKRA在肿瘤治疗中也起到重要的作用，研究发现PRKRA具有促进癌细胞增值的功能，这为肿瘤治疗研究提供新的靶点。

本发明发现，通过抑制或沉默宿主PRKRA基因，能够抑制PPRV的复制，可作为靶点用于制备抑制小反刍兽疫病毒复制的药物。基于此，本发明以PRKRA基因为靶点，设计了小干扰RNA，所述小干扰RNA能够干扰PPRV的复制，可用于制备抑制PPRV复制的药物。而且为了进一步研究PRKRA基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制，本发明设计了一种特异性靶向PRKRA基因的sgRNA，所述的sgRNA能够特异性靶向PRKRA基因，结合CRISPR-Cas9技术实现了PRKRA基因的完全敲除，获得的单克隆细胞系PRKRA-KOs对PPRV具有抗性表型，能够显著抑制PPRV在细胞内的复制，为研究PRKRA基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供了研究工具和材料，也可用于抗PPRV的动物育种。