[发明专利]利用蛋白相变发生干扰治疗衰老相关破坏性疾病的方法

权利要求书

1.一种利用蛋白相变发生干扰治疗衰老相关破坏性疾病的方法，其特征在于：干扰方法及相关靶向药物针对相变蛋白自身序列无序序列所设计，体内外对相变调控及功能验证均针对该相变蛋白自身功能特性。

2.根据权利要求1所述的利用蛋白相变发生干扰治疗衰老相关破坏性疾病的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：进行相变蛋白序列分析的步骤；

S2：进行特异性蛋白短肽设计的步骤；

S3：进行相变蛋白自身纯化以及蛋白短肽合成或纯化的步骤；

S4：进行蛋白短肽体外破环相变验证的步骤；

S5：进行蛋白短肽药物体内破坏相变验证的步骤；

S6：进行蛋白短肽药物体内破坏相变后功能验证的步骤。

3.根据权利要求2所述的利用蛋白相变发生干扰治疗衰老相关破坏性疾病的方法，其特征在于，进行相变蛋白序列分析的步骤具体包括：

利用PONDR的4种预测方式预测蛋白的无序序列，同时利用SEG program三种方式分析蛋白自身低复杂序列。

4.根据权利要求3所述的利用蛋白相变发生干扰治疗衰老相关破坏性疾病的方法，其特征在于，进行相变蛋白序列分析的步骤具体包括：

将PONDR与SEG program所预测的无序序列及低复杂序列最高的蛋白序列分段设计成具有破环蛋白相变潜能的蛋白短肽；

具体设计理念原理为：在蛋白相变时，蛋白单个分子会通过疏水分子彼此结合在一起，形成小液滴似的物理结构，而所设计的处于疏水区间的蛋白短肽在蛋白相变时竞争性的与单个蛋白分子疏水区间结合从而达到特异性破坏该分子蛋白相变的目的。

5.根据权利要求2所述的利用蛋白相变发生干扰治疗衰老相关破坏性疾病的方法，其特征在于，进行相变蛋白自身纯化以及蛋白短肽合成或纯化的步骤具体包括：

S51：构建纯化相变蛋白及蛋白短肽的表达质粒，其具体操作步骤如下：

按照商品化RNA提取试剂盒使用说明书提取待设计相变蛋白的种属性提取全基因的RNA，并制备cDNA；

PCR扩增：50μL PCR反应液包含：Taq酶25μL、待测样品cDNA 1μL、无核酸酶灭菌水22μL、引物Mix:2μL；

按如下步骤进行扩增：98℃5min；98℃5sec,58℃30sec,72℃sec,循环30次；72℃5min；

按照商品化胶回收试剂盒使用说明书回收PCR片段，并利用Nanodrop 2000测定回收片段的浓度；

酶切：50μL载体酶切体系包含：上游限制性酶切酶1μL、下游限制性酶切酶1μL、pET28a+载体1μg、10X Cutsmart 5μL、无核酸酶灭菌水补齐至50μL；50μL PCR片段酶切体系包含：上游限制性酶切酶1μL、下游限制性酶切酶1μL、PCR片段1μg、10X Cutsmart 5μL、无核酸酶灭菌水补齐至50μL；

T4连接：10μL连接体系包含：1μL T4连接酶、酶切后载体与酶切后片段的摩尔比＝1:3、T4连接酶buffer 1μL,无核酸酶灭菌水6μL；16℃连接过夜；

转化DH5α：按照商品化大肠杆菌DH5α感受态使用说明书将上述连接产物转化入DH5α中，并37℃倒置过夜培养；

质粒验证：挑取1至3个单克隆按照商品化质粒小量提取试剂盒进行质粒抽提，并且进行进一步的酶切验证，酶切验证体系如下：上游限制性酶切酶1μL、下游限制性酶切酶1μL、pET28a+质粒1μg、10X Cutsmart 5μL、无核酸酶灭菌水补齐至50μL，挑取验证正确的质粒进行二代测序以进一步验证插入pET28a+PCR片段的正确性；

S52：蛋白与短肽表达，其具体操作步骤如下：

转化BL21:按照商品化大肠杆菌BL21感受态使用说明书将测序正确的质粒转入BL21，并37℃倒置过夜培养；

蛋白表达：首先挑取单克隆于15ml LB溶液中，37℃，220rpm进行过夜培养；然后将15ml过夜培养的细胞溶液加入2L LB溶液中,37℃，220rpm进行扩大培养至OD600＝1.8-1；向上述溶液中加入终浓度为1mM的IPTG进行蛋白表达诱导，并16℃诱导过夜；

S53：蛋白与短肽纯化，其具体操作步骤如下：

利用Ni-NTA resins进行蛋白纯化：收集菌液：3800rpm,15min，加入20ml预冷的含有1mM PMSF于1：100稀释的cocktail的lysis buffer；

超声破碎：利用超声破碎仪于冰水混合物中，120W,超声5sec,停7sec，直至菌液完全澄清；

上柱：将破碎后的混合物于4℃，12000rpm离心20min,上清全部加入25ml的重力层析柱中，并加入4ml Ni-NTA resins,4℃孵育3h；

洗涤及洗脱：将孵育后的裂解液流出，并先后利用wash buffer 1,wash buffer 2对柱内beads进行3至4个柱体积的杂蛋白洗涤；最后使用16ml elution buffer对目的蛋白进行洗脱；

换液及浓缩：利用Amicon Ultra 30K将相变蛋白洗脱液浓缩至100～350μM，4℃同时与PBS缓冲液进行交换，利用Amicon Ultra 1K将蛋白短肽洗脱液浓缩至100～350μM，4℃同时与PBS缓冲液进行交换浓缩的蛋白质分装为10μL/管，液氮中快速冷冻，并储存在-80℃一遍进行下一步实验。