[发明专利]成软骨细胞培养基及成软骨细胞的培养方法

说明书

本发明公开了一种成软骨细胞培养基及成软骨细胞的培养方法；其中，培养基包括1%~10%胎牛血清的DMEM培养基、终浓度为0.5~1.5g/ml的鹿角胶、终浓度为0.1~0.2g/m的氨基葡萄糖、终浓度为0.8~1.2ng/ml的TGF‑β及PBS缓冲液。培养基中的鹿角胶和氨基葡萄糖能刺激脂肪干细胞向成软骨细胞分化，且分化效率可达到72%；TGF‑β细胞因子保证细胞原有的活性，同时具有调节刺激活性、促进成软骨细胞生长。

技术领域

本发明涉及生物细胞培养领域，尤其涉及一种成软骨细胞培养基及成软骨细胞的培养方法。

背景技术

关节软骨损伤引起的病变，在临床上较为常见，软骨创伤极难修复，因为软骨组织没有血管和神经，也就决定了软骨不可再生。关节软骨的损伤会导致患者的关节反复疼痛和活动受限，严重影响患者的日常生活。现阶段，对于关节软骨疾病的治疗，其一是，关节冲洗、微裂缝等手术治疗；其二是，自身其他部位采集软骨组织移植到缺损部分进行修复；其三，将软骨种子细胞接种到合适的生物支架材料上形成复合物植入软骨缺损出，实现软骨组织结构和功能再生。然而，治疗软管疾病的第一种方法，只适合于短期改善患者的临床症状，长期疗效不理想；第二种方法，自身可提供采集软骨组织的部位和数量有限；第三中方法，属于软骨组织工程技术，其生物支架材料、种子细胞等的选取有限，且成软骨细胞分化效率低。

发明内容

基于上述问题，本发明所要解决的问题之一在于提供一种成软骨细胞分化效率高、不受取材限制且适用于长期改善患者软骨疾病的成软骨细胞培养基。

本发明所要解决的问题二在于提供一种使用脂肪干细胞转化成软骨细胞的培养方法。

本发明的技术方案如下：

一种成软骨细胞培养基，包括1%~10%胎牛血清的DMEM培养基、终浓度为0.5~1.5g/ml的鹿角胶、终浓度为0.1~0.2g/m的氨基葡萄糖、终浓度为0.8~1.2ng/ml 的TGF-β及PBS缓冲液。

较好地，所述成软骨细胞培养基中，还包括终浓度 1.0~2.0g/ml的脯氨酸、终浓度0.5~ 1.5g/ml的丙酮酸钠及终浓度 1.0~1.5ng/ml 的IFN-γ中的至少一种。

较好地，所述成软骨细胞培养基中，还包括终浓度 1.0~3.0g/ml的维生素E及终浓度 0.5~4.0g/ml的维生素C。

较好地，所述成软骨细胞培养基中，还包括终浓度为0.5~5μg/ml的AMD3100、终浓度为0.01~0.1ng/ml的BMP-4及终浓度为10~20μg/ml的胰岛素。

本发明还提供一种成软骨细胞的培养方法，包括如下步骤：

S1、取成软骨细胞培养基基置于培养器皿中，并往培养器皿中加入脂肪干细胞，进行细胞培养；所述成软骨细胞培养基中含终浓度为0.5~1.5g/ml的鹿角胶、终浓度为0.1~0.2g/m的氨基葡萄糖及终浓度为0.8~1.2ng/ml 的TGF-β；

S2、第3日换液，添加所述培养基继续细胞培养；

S3、第6日，清洗，取样进行细胞计数，调整细胞浓度在2.0×10⁵/ml~3.0×10⁵/ml；继续培养；

S4、第9日至22日，每隔2-3日换液一次，继续添加所述培养基继续细胞培养；

S5、第25日换液，再次添加添加所述培养基继续细胞培养；

S6、第28日，停止培养，所述脂肪干细胞已经完成细胞分化培养，即得到成软骨细胞。

较好地，所述培养方法中，所述脂肪干细胞为P2代脂肪干细胞。

较好地，所述培养方法的步骤S2中，第3日换液所用培养基中含有终浓度为1.0~2.0g/ml的脯氨酸、终浓度0.5~1.5g/ml的丙酮酸钠及终浓度 1.0~1.5ng/ml 的IFN-γ。