[发明专利]一种稳定表达几丁二糖脱乙酰酶的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种稳定表达几丁二糖脱乙酰酶的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明通过筛选整合位点，提高整合拷贝数，构建了可以稳定高效表达几丁二糖脱乙酰酶Dac的食品安全级工程菌株。与现有技术相比，几丁二糖脱乙酰酶胞外酶活得到了极大的提高，发酵周期大大缩短。本转化方法简单易行，条件温和，高效环保，产物得率高。此法有利于解决传统合成法中污染严重，产率低下等问题，而且此法易于控制，利于推广应用。

技术领域

本发明涉及一种稳定表达几丁二糖脱乙酰酶的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

几丁二糖脱乙酰酶Dac来源于极端嗜热古菌Pyrococcus horikoshii，它对乙酰氨基葡萄糖单体具有很高的催化活性，与化学水解法和微生物催化法生产氨基葡萄糖GlcN相比，酶法催化具有原料来源丰富，且价格低廉，生产工艺简单等优点。几丁二糖脱乙酰酶Dac高效稳定表达体系的建立，可为氨基葡萄糖GlcN的一步生产带来便利。

氨基葡萄糖GlcN是一种氨基己糖，作为一种参与构造人体组织和细胞膜的功能性单糖，它可被应用到多个领域。在免疫调节方面，氨基葡萄糖GlcN参加体内的糖代谢，参与对机体的保护作用；在治疗骨关节炎方面，氨基葡萄糖GlcN是形成人体软骨细胞的重要营养素，是健康关节软骨的天然组织成份。在抗氧化、抗衰老方面，氨基葡萄糖GlcN能够极好的螯合Fe²⁺，同时能保护脂质大分子不被羟基自由基氧化损害，具有抗氧化能力。

目前针对几丁二糖脱乙酰酶Dac的生产研究主要集中在基因克隆和异源表达上。为了大量获得胞外表达的几丁二糖脱乙酰酶Dac，研究人员往往采用高拷贝质粒游离表达目的基因。通过表达元件的优化，从转录、翻译以及转运等层面提高几丁二糖脱乙酰酶Dac的表达，从而间接提高酶活；通过对酶自身分子结构进行半理性改造，将酶与底物结合关键位点上的氨基酸进行突变，提高与底物的结合能力；对酶自身分子结构的半理性改造，不仅用于提高酶与底物的结合能力，还可以通过改变酶表面电荷来改变最适pH，从而提高酶在特定工业生产环境下的催化性能。

例如记载于公开号为CN109777761B的中国发明专利中，公开了一种分泌表达几丁二糖脱乙酰酶Dac的工程菌及其构建方法，通过融合表达几丁二糖脱乙酰酶Dac与yncM信号肽，并获得了5’端的非翻译区突变体，发酵60h胞外酶活最高为1548.7U/ml。

但是，枯草芽孢杆菌中一些用于基因表达的高拷贝质粒不稳定,在复制过程中容易形成单链DNA中间体,从而导致蛋白质产量低，这些问题在大规模工业发酵过程中尤为显著。在生产目的蛋白时，游离型表达质粒继代过程中容易丢失，导致了细胞的生产性能不稳定。现如今质粒不稳定已经成为工业化应用实现进程中的一大难题。另一方面枯草芽孢杆菌漫长的发酵周期提升了工业化生产成本。所以需要构建整合型表达菌株，提高工程菌株产酶稳定性，并筛选合适的整合位点，缩短发酵周期。

发明内容

为改善异源蛋白游离表达时在继代过程中易丢失，细胞生产性能不稳定的现状，本发明通过基因组整合提供了一种稳定高效持续表达几丁二糖脱乙酰酶Dac的重组工程菌株及其构建方法；为解决枯草芽孢杆菌发酵周期长，工业化生产成本投入高的问题，本发明通过CRISPER/Cpf1基因编辑手段，缩短发酵周期，提供了一种提前稳定表达几丁二糖脱乙酰酶Dac的重组工程菌株及其构建方法。

本发明提供了一种几丁二糖脱乙酰酶Dac表达框，所述表达框的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述的几丁二糖脱乙酰酶Dac表达框包含优化后的启动子p43、核糖体结合位点RBS₁，信号肽突变体NprB₅以及几丁二糖脱乙酰酶Dac基因。

本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体包含了上述几丁二糖脱乙酰酶Dac表达框。

在本发明的一种实施方式中，所述重组载体以pP43NMK质粒为表达载体。