[发明专利]一种快速检测粮食中百菌清残留的试纸条的制备方法

权利要求书

1.一种快速检测粮食中百菌清残留的试纸条的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)荧光探针的制备：采用铕纳米材料与单抗偶联制备荧光探针，取800μL 0.2moL/L的硼酸缓冲液于2mL的离心管中，加入200μL聚苯乙烯荧光微球乳胶，涡旋混匀；将离心管置于数控高功率超声仪中超声12-18min，以使乳胶材料在溶液中均匀分散；加入40μL 15mg/mL的EDC水溶液，室温下涡旋振荡10-20min；然后14000r/min，10℃条件下高速离心10min，弃上清以去除过量的EDC，沉淀物用1mL硼酸缓冲液复溶，重复超声步骤；加入一定量的抗体水溶液涡旋混匀，并转移至摇床振荡器上室温振荡12h，使抗体与微球材料充分偶联；重复离心步骤，弃上清以去除未偶联的抗体，下层沉淀用1mL含0.5％BSA的硼酸缓冲液复溶，再次重复超声步骤使其均匀分散；随后转移至摇床振荡器上室温振荡2-5h，以封闭微球材料表面的未结合位点；待反应完成后，将制得的探针于4℃条件下保存备用。

(2)时间分辨荧光免疫层析试纸条的检测条件筛选：偶联铕的单抗标记浓度(抗CTN-单克隆抗体50-100μg/mL)、荧光探针用量(进行50、100、200、300、400和500倍的稀释使用)、检测线上检测抗原浓度(CTA-BSA 2-5mg/mL)、检测线抗原喷涂速率(0.4～0.8μL/cm)。

(3)时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备：在NC膜上喷涂抗原CTA-BSA作为T检测线，羊抗鼠IgG作为质控线(C线)，包被后置于37℃的鼓风干燥箱中烘2h，将样品垫、吸水纸、NC膜与PVC底板进行组装，切成宽3mm的试纸条后避光干燥备用。

(4)样品的检测：①样品前处理：粮食粉碎过20目筛，分装避光保存；②提取时间的筛选：准确称取1.0g粮食样品，分别加入5mL提取剂70％甲醇水，充分振荡3-10min，室温离心(4000r/min，5min)；取100μL上清液，用样品缓冲液稀释4倍，制得待测样品液；③样品提取液稀释比例的选择(样品提取液与反应缓释液的稀释比例设置为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5)；④检测分析：取100μL样品缓冲液或待测样品液，加入含有荧光探针的微孔中吹打混匀，37℃孵育2-5min；将试纸条插入微孔，37℃反应5-10min，随后对荧光层析试纸条进行检测分析。定性分析：在紫外灯下通过肉眼判断定性结果，当含有一定浓度待测物时，T线不显线，C线显红色荧光，则结果为阳性；相反，当无待测物时T线和C线均显红色荧光，结果为阴性。定量分析：反应结束后30s内，将荧光层析试纸条插入荧光读数仪读取结果，得到被测粮食中百菌清的含量。

(5)准确度评价：对含有50μg/kg百菌清的空白粮食样品分别采用该时间分辨荧光免疫层析定量分析法和气相色谱串联质谱仪(GC-MS/MS)测定两种检测方法进行检测，并对检测结果的一致性进行分析。

2.根据权利要求1所述的一种快速检测粮食中百菌清残留的试纸条的制备方法，其特征在于：步骤(1)采用铕纳米材料与单抗偶联制备荧光探针的方法为：取800μL 0.2moL/L的硼酸缓冲液于2mL的离心管中，加入200μL聚苯乙烯荧光微球乳胶，涡旋混匀；将离心管置于数控高功率超声仪中超声12-18min，以使乳胶材料在溶液中均匀分散；加入40μL 15mg/mL的EDC水溶液，室温下涡旋振荡10-20min；然后14000r/min，10℃条件下高速离心10min，弃上清以去除过量的EDC，沉淀物用1mL硼酸缓冲液复溶，重复超声步骤；加入一定量的抗体水溶液涡旋混匀，并转移至摇床振荡器上室温振荡12h，使抗体与微球材料充分偶联；重复离心步骤，弃上清以去除未偶联的抗体，下层沉淀用1mL含0.5％BSA的硼酸缓冲液复溶，再次重复超声步骤使其均匀分散；随后转移至摇床振荡器上室温振荡2-5h，以封闭微球材料表面的未结合位点；待反应完成后，将制得的探针于4℃条件下保存备用。

3.根据权利要求1所述的一种快速检测粮食中百菌清残留的试纸条的制备方法，其特征在于：步骤(1)荧光探针的制备方法中荧光微球乳胶溶液的超声时间为12-18min，荧光微球的震荡活化时间为10-20min，加入抗体后的震荡反应时间为2-5h。