[发明专利]一种从固氮蓝藻中分离纯化高纯度藻胆蛋白的方法及藻胆蛋白

说明书

本发明公开了一种从固氮蓝藻中分离纯化高纯度藻胆蛋白的方法，包括：取一株固氮蓝藻，接种于BG11培养基中，光照培养，离心收集藻液，二次离心，去上清，获得藻体；然后将藻体重悬于PBS缓冲液中，获得PBS藻体重悬液；接着，反复冻融PBS藻体重悬液，离心，获得藻胆蛋白粗提液；接着，将藻胆蛋白粗提液加入到双水相体系中，初步纯化获得藻胆蛋白提取液；接着，采用羟基磷灰石柱，采取不同离子梯度进行等度洗脱藻胆蛋白提取液，然后经透析除盐获得微藻藻胆蛋白。本发明还公开了采用上述方法制备获得藻胆蛋白。本发明采用不同浓度等离子强度洗脱工艺，可同时实现高纯度藻红蛋白和藻蓝蛋白的分离纯化，原料利用率高。

技术领域

本发明属于生化分离技术领域，具体地涉及一种从固氮蓝藻中分离纯化高纯度藻胆蛋白的方法及藻胆蛋白。

背景技术

藻类是一类能进行光合作用的微生物，属于原生生物的一种，可分为单细胞微藻和巨藻。藻胆体或色素体主要存在于蓝藻和红藻中，是其主要的捕光天线复合物，藻胆体一般由多种藻胆蛋白和连接蛋白组成，藻胆蛋白则是由藻胆素或色基与相应的脱辅基蛋白通过硫醚键共价连接而成。不同藻胆蛋白的结构基本相似，脱辅基蛋白一般由α、β亚基组成，少数含有γ亚基，α、β亚基多形成三聚体或六聚体，γ亚基多存在于六聚体中起到稳定结构的作用。藻胆蛋白的荧光特性主要由脱辅基蛋白上结合的藻胆素种类、位置、数量决定。藻胆蛋白按照吸收光谱性质藻胆蛋白可分为藻蓝蛋白(Phycocyanin，PC)、藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)和别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)。一般而言，藻胆蛋白的光谱学纯度(A_max/A₂₈₀)越高，售价越高，根据其纯度可细分为食品级(A_max/A₂₈₀0.7)，药品级(A_max/A₂₈₀3.0)和试剂级(A_max/A₂₈₀4.0)。藻胆蛋白具有抗氧化性、抗炎性、抗衰老性、抗癌性和免疫荧光性等功能，被广泛用作天然色素(食品、护肤品、染料等)、医药保健品和分子生物学研究中的荧光试剂，潜在市场需求巨大。

固氮蓝藻是一类低等原核植物。它能进行固氮作用，固定空气中分子态氮成为氮素化合物；又能进行光合作用，将二氧化碳变为碳素化合物并放出氧气，为自身的固氮提供能源和还原剂。其细胞中含有的叶绿素a能够进行产氧型光合作用；其异形细胞(heterocyst)是进行固氮的场所；细胞能分泌胞外多糖(EPS)，EPS为多聚阴离子大分子，可与阳离子相互作用，它对Na⁺的吸附能影响外环境pH改变。

藻胆蛋白这类胞内活性物质的获取主要分为提取和纯化两个过程。就提取而言，主要是通过物理方法处理达到细胞破碎的效果，离心收集细胞破碎液，即藻胆蛋白粗提液。目前常用的细胞破碎方法有浸提法、玻璃珠研磨法、液氮研磨法、匀浆机处理法、超声破碎法。例如：发明专利CN 104292316 B中采取粉碎后浸提的方法提取龙须菜中的R-型藻红蛋白，该方法耗时长，仅浸提这一步需要24-48h。中国专利申请CN109206504 A中采取混合研磨和超声波破碎结合的方法提取螺旋藻中的藻蓝蛋白，该提取方法复杂，鉴于超声波破碎仪的局限性，该方法在高纯度藻胆蛋白的大规模工业化生产上不可行。