[发明专利]杆状病毒荧光纳米探针

说明书

本发明公开了一种杆状病毒荧光纳米探针，先通过自生物素化标记杆状病毒包膜糖蛋白GP64，然后利用杆状病毒复制和自组装过程将其基因组标记上钌复合物[Ru(phen)₂dppz]²⁺，制成荧光信号放大纳米探针。本发明能够根据病毒基因组中结合的钌复合物的荧光信号值，用于核酸的检测与分析以及生物成像。

技术领域

本发明属于微生物的技术领域，特别涉及一种用于细胞成像、致病菌检测、核酸检测等的杆状病毒荧光纳米探针。

背景技术

杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒，其基因组大小为80-180kb，在自然界中以节肢动物作为专一性宿主进行感染和传播。杆状病毒其具有两种不同的病毒粒子形态：一种为出芽型的病毒粒子(budded virus,BV)，主要介导细胞与细胞之间的系统感染，入侵细胞是通过受体介导的内吞作用；另一种为包埋型的病毒粒子(Occlusion-derived virus,ODV)，在病毒的口服感染过程中，节肢动物肠道碱性环境使包埋型的病毒粒子外壳脱落，萌发成具有侵染能力的病毒并感染肠道细胞达到病毒传播。

目前已知基因组全序列的核型多角体杆状病毒有苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒、家蚕核多角体病毒、黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒、舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒、甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒、棉铃虫核型多角体病毒，以及斜纹夜蛾核型多角体病毒，其中以AcMNPV研究最为深入，在生物农药、真核表达系统等领域具有重要的应用价值。

AcMNPV的基因表达分为4个阶段:立早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。

前两个阶段的基因表达早于DNA复制，而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白——多角体蛋白和P10蛋白。多角体蛋白是形成包涵体病毒的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％～50％，是病毒复制的非必需成分，但对病毒粒子有一定的保护作用。

另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，也是一类病毒复制的非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，这可能与细胞溶解有关。多角体基因和P10基因的启动子具有较强的启动能力，且均为病毒复制的非必需成分，因此这两个基因位点成为了杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。

然而，对此的应用也局限于生物农药、真核表达等领域。

发明内容

基于此，因此本发明的首要目地是提供一种杆状病毒荧光纳米探针，该探针能够根据病毒基因组中结合的钌复合物的荧光信号值，用于核酸的检测与分析以及生物成像，具有超灵敏度检测能力，能够提高对DNA检测的灵敏度和准确度。

本发明的另一个目地在于提供一种杆状病毒荧光纳米探针，该探针在水化聚合物存在情况下均发光，从而产生很好的标识作用，能够广泛应用于细胞成像、致病菌检测、核酸检测。

申请人研究发现：生物素中包含有色氨酸残基，结合力Kd值高达10-15mol/L，比抗原抗体间结合力高一万倍，亲和力高、灵敏度高、特异性强、稳定性好和多级放大作用。生物素受体多肽(简称AP-tag或Avi-Tag)，包含有15个氨基酸残基组成的短肽标签，而赖氨酸残基反应条件温和、专一性极高、高效、对蛋白构象及活性影响极低、操作方便；活化生物素形成生物酰-5’-腺苷酸转移生物素到生物素受体蛋白上，形成钌复合物[Ru(phen)₂dppz]²⁺，钌复合物在水中不发光，但在非水溶剂(乙醇、乙腈)中和在水化聚合物(如DNA)存在情况下均发光，为此具有很好的标识作用。如果能将其与杆状病毒结合，则具有良好的检测能力。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：