[发明专利]一种石竹属花卉中花色苷的高效液相色谱检测方法

权利要求书

1.一种石竹属花卉的花色苷物质成分的分离鉴定方法，其特征在于下列步骤：

(1)利用甲醇-盐配制的水溶液作为浸提液提取石竹属花卉中花色苷物质：准确称取0.5-1g石竹属花卉的花瓣样品，在液氮中研磨至粉末状，加入500μL甲醇-盐酸浸提液，该浸提液的制备方法为，用含0.1％盐酸的50％甲醇水溶液，即为甲醇-盐酸浸提液，于涡旋仪上振荡混匀10min，再置于冰浴超声波清洗仪中20min，得到上清液，将所得上清液保存于进样瓶中，待用；

(2)利用高效液相色谱质谱联用方法进行检测分析：将步骤(1)所得的石竹属花卉中花色苷物质即上清液进行定性和定量分析，具体步骤为；

1)液相色谱条件：使用ACQUITY BEH C18柱，该色谱柱规格为2.1mm*100mm，1.7μm；流动相以含0.1％甲酸的超纯水为A相，以含0.1％甲酸的乙腈为B相；柱温设定为40℃，流速设定为0.35ml/min，进样量设定为2μL；洗脱梯度为：当仪器从开始运行检测的0.00min时，设定B相体积百分比为5％，当仪器运行检测至5.00min时，将B相体积百分比增至20％；当仪器运行检测至15.00min时，将B相体积百分比增至40％，当仪器运行检测至25min时，将B相体积百分比增至100％，并保持1min；当仪器运行检测至26min时，将B相体积百分比降至5％，并平衡至4min；

2)质谱条件：电喷雾离子源，离子源温度设为550℃，正离子模式下质谱电压设为5500V，气帘气设为35psi，负离子模式同正离子模式；

(3)在一个定量过程中，所得化合物含量按标准曲线法进行计算，具体步骤为；

1)建立标准曲线：配制所需花色苷物质不同浓度的溶液，进行梯度试验，溶液梯度浓度分别为0.01ng/mL；0.05ng/mL；0.1ng/mL；0.5ng/mL；1ng/mL；5ng/mL；10ng/mL；50ng/mL；100ng/mL；500ng/mL；1000ng/mL；2000ng/mL；50000ng/mL，获取各个浓度标准品的对应质谱峰面积，以所用标准品浓度为横坐标，以获取的质谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到如下线性方程：y＝4.58481e4x-1.70406e6，相关系数R²＝0.99781；

2)质谱数据的处理：利用Compound Discoverer3.1.1软件处理质谱数据，确定目标物质出峰时间，去除杂峰，手动积分计算目标物质峰面积；将检测到的目标物质的峰面积代入该物质的标准曲线线性方程中进行计算，得到该物质的相对含量，即单位为ng/mL；利用以下公式计算得到该物质在样品中的绝对含量：某物质的绝对含量(μg/g)＝c*V/m*1×10⁶，式中c为通过标准曲线计算得到的该物质在样品中的相对含量即ng/mL，V为所用浸提液的体积(μL)，m为称取的样品质量。

2.如权利要求1所述的一种石竹属花卉的花色苷物质成分的分离鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中提取石竹属花卉花色苷物质的方法还包括在12000rmp下离心5min，吸取上清液，重复上述离心操作三次，合并上清液，将上清液保存于进样瓶中高效液相色谱质谱联用(HPLC-MS)分析。

3.如权利要求1所述的一种石竹属花卉的花色苷物质成分的分离鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中利用高效液相色谱质谱联用检出的花色苷物质成分进行定性分析过程中，未知化合物通过标准品比对与mzCloud数据库检索结合方式对其中花色苷物质成分进行定性分析，通过对目标物质与标准品的色谱图进行对比，按照组份保留时间进行定性分析；同样地，通过对目标物质进行二级质谱分析，判断其与mzCloud数据库中所含物质匹配度在98％以上的作为定性标准。