[发明专利]固态纳米孔-荧光共振能量转移复合检测方法及系统

说明书

本发明公开了一种固态纳米孔‑荧光共振能量转移复合检测方法，该方法用成对的荧光基团同时标记的分析物分子，采用共聚焦显微镜聚焦于纳米孔所在的平面，分析物在电场的驱动下通过纳米孔，同时也通过共聚焦显微镜的焦平面，当发生荧光共振能量转移，激发光信号被共聚焦显微镜捕捉并转换为电信号经计算机处理，结合分析物分子通过纳米孔的电信号，从而复合解析分子构象信息。本发明还公开了一种固态纳米孔‑荧光共振能量转移复合检测系统。本发明系统和检测方法能够更有效地进一步区分生物分子内部或生物分子之间细微构象差异，适用于多种分析物单独检测和不同的分析物混合检测。

技术领域

本发明属于单分子检测技术，特别是涉及一种用于单分子构象检测的固态纳米孔-荧光共振能量转移复合检测方法及系统。

背景技术

固态纳米孔作为一种单分子平台可以检测生物分子的构象变化，对于研究其结构和功能有重要意义。固态纳米孔是电泳单分子传感器，由纳米级别的超薄绝缘膜以及被该绝缘膜分隔开来的两个含有离子溶液的纳米级腔室组成。当两侧腔室施加合适的电压、压力或渗透压时，纳米孔可以利用检测通过孔的离子电流来探测带电的生物分子(例如DNA、RNA、蛋白质等)，当分析物占据纳米孔中的一部分体积时，孔内溶液电导率会受到改变，从而导致离子电流的可测量变化。分析物不同的构象可以呈现出不同幅度或不同形状的电流信号，电流变化的持续时间也有所不同。然而，传统纳米孔只能对物质的在孔内部分的轮廓、体积信息进行分辨。溶液中生物分子的构象差异往往复杂多变，一些细小的变化可能具有重要的生物学意义，受纳米孔分辨率的影响，这些局部细微的构象改变无法通过离子电流区分开来。

荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团中，当一个供体荧光分子的荧光光谱与另一个受体荧光分子的激发光谱具有重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。荧光共振能量转移的强度和供体、受体的间隔距离的6次方呈反比，因而可以极为灵敏地检测分子间或分子内部不同结构域的纳米级尺度的距离变化。

目前未见固态纳米孔平台单分子检测和荧光共振能量转移技术的结合研究及应用。

发明内容

发明目的：针对上述现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种固态纳米孔-荧光共振能量转移复合检测方法即系统。

技术方案：本发明所述的一种固态纳米孔-荧光共振能量转移复合检测方法，首先采用荧光显微镜聚焦于固态纳米孔所在的平面，然后用成对的荧光基团同时标记待分析物分子，在待分析物分子通过纳米孔时，采集待分析物分子过孔电流信号以及标记荧光基团间的荧光共振能量转移信号强度，在时间上匹配特征光、电信号，复合解析分子构象信息。

本发明所用的固态纳米孔检测装置可以为：包括氮化硅固态纳米孔芯片、Ag电极、膜片钳设备Axon 200B，Ag电极与膜片钳系统电极夹持装置相连接，从而可以在纳米孔芯片的两次施加电压。

所述纳米孔芯片孔径大小根据分析物分子的大小，可供选择的范围为2nm-350nm。

使用纳米孔芯片前需要用氧plasma等离子体清洗仪处理三分钟。对于Ag/AgCl电极，要用砂纸打磨去除表面氧化物，再在氯化铁溶液中浸泡，用纯水冲洗干净后晾干。

分析物与荧光团混合孵育后离心，过葡聚糖凝胶洗柱，用PBS洗脱。用注射器缓慢地将用荧光团标记后的样品推入纳米孔芯片一侧腔室中。Ag电极与溶液接触并固定，与膜片钳系统相连，包括膜片钳放大器、数模/模数信号转换器和数据分析系统，分析物通过纳米孔的信号由电流幅度变化的形式呈现。