[发明专利]一种以基因工程水稻表达和制备重组瑞替普酶的方法

说明书

本发明公开了一种经水稻密码子优化的重组瑞替普酶基因，相关载体及制备基因工程水稻种子的方法和重组瑞替普酶分离纯化方法。将基因工程稻谷加工粉碎后与提取缓冲液混合，提取过滤后得到含重组瑞替普酶的粗提取物；分离纯化步骤依次包括：1)将含重组瑞替普酶的粗提取物进行阳离子交换层析，得到初级产物I；2)将初级产物I进行疏水层析，得到中间产物II；3)将中间产物II进行苯甲脒亲和层析，得到纯化的重组瑞替普酶。该方法无需体外复性，安全性高，容易规模化，所获得的重组瑞替普酶达到98％以上的HPLC纯度。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及以基因工程水稻为生物反应器，表达和分离纯化重组瑞替普酶的方法。

背景技术

瑞替普酶(Reteplase，简称r-PA)为第三代溶栓药物，分子量约39.6kDa，355个氨基酸组成，是重组人组织型纤溶酶原激酶(Tissue-type plasminogen activator，t-PA)的衍生物，可以使纤维蛋白溶解酶原激活为有活性的纤溶蛋白溶解酶，以降解血栓中的纤维蛋白，发挥溶栓作用。r-PA适用于成人由冠状动脉梗塞引起的急性心肌梗塞的溶栓疗法，能够改善心肌梗塞后的心室功能。

心脑血管疾病是危害人类生命和健康的主要疾病之一，其中血栓类疾病的发病率、致残率和死亡率均远远高于其他疾病。据我国卫生部资料显示，我国有超过千万的血栓病患者，每年死于血栓疾病的人数就超过200万，占总死亡人数的50％以上，且血栓疾病在我国已呈现明显上升趋势。目前国内溶栓药物市场以第一代、第二代产品为主，其中阿替普酶(t-PA)、蚓激酶和纤溶酶收入占比分别为30％、29％、26％，排名前三位，均为国家医保乙类产品。第二代的阿替普酶是国外使用最多的溶栓剂，我国市场上的阿替普酶则完全依赖进口，勃林格殷格翰的爱通立占有100％的市场份额。阿替普酶的一个主要劣势是半衰期短，仅为4-6分钟，需要持续静脉给药。第一代溶栓剂已经退出欧美市场，但是由于价格便宜，仍然在我国基层医院广泛使用，占有极大的市场份额。第三代溶栓药物r-PA是应用基因工程技术将天然人组织纤溶酶原激活剂t-PA的Fg(指型区)，EGF(生长因子区)，K1(环状结构域)区去除，保留了第1～3和176～527位氨基酸的一种非糖基化重组组织纤溶酶原激活剂，也就是t-PA的中间缺失体，删除了与肝内灭活相关的结构区域。因此，具有较长的半衰期(15～18min)，无免疫原性，能拮抗一些抑制剂，溶栓能力强，给药方便，不需要按个体给药，可短时间，小剂量给药，快速溶栓，相比于第二代溶栓药物t-PA具有提高特异性溶栓效率、延长半衰期，减少全身系统性出血，且具有血管再通率高、无过敏反应、无毒副作用等优点，故r-PA具有更大的应用前景。

目前已成功在大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞以及丝状真菌中进行了r-PA的表达，但是至今未见有关使用水稻胚乳来大规模生产重组瑞替普酶的报道，涉及到的纯化方法：(1)大肠杆菌表达后形成无活性的包涵体，体外需要进行二硫键配对复性，利用刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)能够特异性结合r-PA的特点，用ETI-Sepharose 4B亲和层析柱，分离得到r-PA；(2)利用转基因兔乳表达r-PA，通过硫酸铵沉淀、酸碱沉淀、超滤、亲和层析(LysineHyperD、Blue Sepharose 6FF)、离子交换(SP BestaroseTM FF)、凝胶过滤(Surpdex G75)等方法分离纯化r-PA，未见有关从水稻种子中分离纯化重组瑞替普酶方法的报道。国内市售药派通欣在大肠杆菌中表达，但是大肠杆菌表达后无活性，需要体外复性等操作，而利用水稻胚乳细胞表达系统来高效表达重组r-PA克服了需体外复性等操作，具有绿色、安全、容易规模化等优点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种规模化的利用水稻胚乳细胞生物反应器来高效表达重组瑞替普酶，从基因工程水稻种子中提取和分离纯化重组瑞替普酶(OsrPA)的方法。

为实现水稻胚乳细胞高效表达重组瑞替普酶目的，本发明提供一种从重组瑞替普酶基因工程水稻中提取和分离纯化重组瑞替普酶的方法，包括下述步骤：