[发明专利]使用成对向导RNA进行靶向遗传修饰的方法和组合物

权利要求书

1.一种用于对细胞内的基因组进行修饰的方法，所述基因组对第一等位基因而言为杂合，包括：

(I)使所述基因组与下列物质接触：

(a)第一Cas蛋白；以及

(b)第一向导RNA，其中所述第一向导RNA包含第一tracrRNA和第一CRISPR RNA，所述第一CRISPR RNA与第一非等位基因特异性CRISPR RNA识别序列杂交；其中所述第一等位基因在第一同源染色体上并且所述CRISPR RNA识别序列位于第二同源染色体上与所述第一等位基因相对应的基因座的近着丝粒侧，

其中所述Cas蛋白和所述第一向导RNA天然情况下不会同时存在；且

其中所述Cas蛋白切割所述第一CRISPR RNA识别序列，以产生双链断裂，并且所述细胞经修饰变成对于所述第一等位基因而言是纯合的；且

(II)鉴定对于所述第一等位基因而言是纯合的经修饰的细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(I)包括向所述细胞中引入：(a)所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸；以及(b)第一向导RNA或编码所述第一向导RNA的DNA。

3.根据权利要求2所述的方法，其中步骤(I)包括将编码所述Cas蛋白的核酸引入所述细胞并将所述第一向导RNA引入所述细胞，其中编码所述Cas蛋白的核酸是RNA。

4.根据权利要求2所述的方法，其中步骤(I)包括将编码所述Cas蛋白的核酸和编码所述第一向导RNA的DNA引入所述细胞，其中编码所述Cas蛋白的核酸是DNA。

5.根据权利要求2所述的方法，其中将所述Cas蛋白和所述第一向导RNA作为第一蛋白-RNA复合物引入所述细胞中。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一向导RNA，其中所述第一CRISPR RNA和所述第一tracrRNA是单独的RNA分子，并且其中：

(1)编码所述Cas蛋白的DNA有效连接至第一表达构建体中的第一启动子；和/或

(2)编码所述第一CRISPR RNA的DNA有效连接至第二表达构建体中的第二启动子；和/或

(3)编码所述第一tracrRNA的DNA有效连接至第三表达构建体中的第三启动子；

其中所述第一启动子、所述第二启动子和所述第三启动子在所述细胞中有活性。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一表达构建体、所述第二表达构建体和所述第三表达构建体是单个核酸分子的组分。

8.根据权利要求4所述的方法，其中：

(1)编码所述Cas蛋白的DNA有效连接至第一表达构建体中的第一启动子；和/或

(2)编码所述第一向导RNA的DNA有效连接至第二表达构建体中的第二启动子，

其中所述第一启动子和所述第二启动子在所述细胞中有活性。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一表达构建体和所述第二表达构建体是单个核酸分子的组分。

10.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中在所述双链断裂的端粒侧处出现杂合性丢失。

11.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中步骤(I)还包括将所述基因组与下列物质接触：

(c)第二向导RNA，

其中所述第二向导RNA包含第二tracrRNA和第二CRISPR RNA，所述第二CRISPR RNA与第二非等位基因特异性CRISPR RNA识别序列杂交，所述第二非等位基因特异性CRISPR RNA识别序列位于所述第二同源染色体上与所述第一等位基因相对应的所述基因座的近着丝粒侧，和

其中所述Cas蛋白切割所述第一CRISPR RNA识别序列和所述第二CRISPR RNA识别序列中的至少一个，以产生至少一个双链断裂。