[发明专利]一种MS抗原基因重组痘苗病毒的构建方法

说明书

本申请提供一种MS抗原基因重组痘苗病毒的构建方法，包括以下步骤：根据NCBI基因库中启动子p7.5、启动子p11和TK基因序列构建质粒，得到TKF，TKR基因片段，根据原始质粒全基因序列设计引物，将原始质粒的PTKF基因进行PCR扩增，将扩增后的产物进行双酶切，与TKR基因片段根据酶切位点进行链接后培养，得到PTKF‑TKR质粒；根据PTKF‑TKR质粒全基因序列设计引物，将PTKR基因进行PCR扩增，将扩增后的产物进行双酶切，与TKF基因片段根据酶切位点进行链接后培养，之后进行表达载体构建得到PTKF‑TK‑PTKR质粒；构建重组转移质粒；重组病毒的转染与纯化。

技术领域

本申请涉及重组病毒技术领域，尤其涉及一种MS抗原基因重组痘苗病毒的构建方法。

背景技术

鸡滑液囊支原体(Mycoplasma Synoviae，MS)是引起禽类滑膜炎症，关节肿大的病原微生物，在世界范围内流行。MS一旦感染禽类，发展缓慢，病程长，感染病禽终身带毒。鸡滑液囊支原体病本病可以水平传播和垂直传播，很难根除，发病率高，死亡率低，但易和其他致病菌混合感染，从而病情加重，造成死亡率增高，对养禽业危害极大。鸡滑液囊支原体病是近年来发展较快对禽类危害较大的一种支原体引起的传染病，被世界卫生组织归为B类传染病，由1954年美国发现第一例开始，迅速在英国、挪威、德国、美国、中国等全球范围内传播开，呈世界性分布。我国首例确诊是在1989年的广西地区，随后，全国范围内迅速传播开来，据不完全统计，我国不同省份检测该病，阳性率不低于15％，最高可达55.7％。禽类养殖业是我国农产品的一个重要组成部分，该病严重影响到养禽业的发展。

药物对鸡滑液囊支原体的治疗存在一定效果，但不会完全消除病原菌，并且在治疗过程中，MS易产生耐药性，没有试验表明单一的抗生素可以完全治愈鸡滑液囊支原体病。不同的致病菌株对抗生素的灵敏度不同，目前认为最好的临床治疗的方法是通过对病原菌进行分离后，药敏试验确定需要用于治疗的抗生素的种类。在治疗的过程中，要注意的是耐药性的产生及药物残留。临床治疗显示，在该病发病早期，抗生素治疗效果较好，但是由于该病的不可逆性，对生产造成的影响相比其他传染病要更大。

目前，全球对鸡滑液囊支原体疫苗的试验进展较慢，以药物预防为主。据报道，国际上，以澳大利亚疫苗商品化最为正规，以MS-H菌株为母本的活疫苗，其次包括灭活苗、弱毒苗虽有相关产品但是效果有待考证。我国对鸡滑液囊支原体的试验发展相对缓慢，大多以药物预防为主，对发病鸡群主要以抗生素治疗为主，长期使用会出现明显的耐药性和药物残留，因此疫苗的使用就成为该病防控的重要方法。目前，仅有澳大利亚的一株通过基因突变筛选出的温度敏感性弱毒苗(MS-H)，灭活苗与基因工程苗目前都处于研发阶段。现有的灭活疫苗在实际生产中存在价格高，免疫持续期短等不足之处。

发明内容

本申请提供了一种MS抗原基因重组痘苗病毒的构建方法，以解决现有的灭活疫苗在实际生产中存在价格高，免疫持续期短等不足的问题。

本申请提供一种MS抗原基因重组痘苗病毒的构建方法，包括如下步骤：

S1：构建重组表达载体；

S11：根据NCBI基因库中启动子p7.5、启动子p11和TK基因序列构建质粒：选取以TK基因为中心的3000bp基因序列，设计引物，将TK基因分为两段进行PCR扩增，扩增后每段长度分别为1500bp，得到TKF，TKR基因片段，并分别进行双酶切；其中酶切位点为MfeⅠ，SacⅠ以及AscⅠ，XmaⅠ；

S12：根据原始质粒全基因序列设计引物，将原始质粒的PTKF基因进行PCR扩增，将扩增后的产物进行双酶切，与所述TKR基因片段根据酶切位点进行链接后转至大肠杆菌TOP10克隆菌株培养，得到PTKF-TKR质粒；

S13：根据PTKF-TKR质粒全基因序列设计引物，将PTKR基因进行PCR扩增，将扩增后的产物进行双酶切，与所述TKF基因片段根据酶切位点进行链接后转至大肠杆菌TOP10克隆菌株培养，之后进行表达载体构建得到PTKF-TK-PTKR质粒；