[发明专利]一种ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的合成方法及其应用

权利要求书

1.一种ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的合成方法，其特征在于：包括，

将全乙酰化的壳二糖1在无水条件下溶于二氯甲烷与甲醇混合溶液中，加入甲醇钠，反应生成中间体2；

将中间体2溶于饱和碳酸氢氨溶液中，反应得到中间体3；

将中间体3溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入N-芴甲氧羰酰甘氨酸五氟苯酯和吡啶，反应生成中间体4；

将中间体4溶于缓冲溶液中，加入供体二磷酸尿甘半乳糖，在β1，4半乳糖转移酶的催化下生成中间体5；

向反应生成中间体5的反应混合溶液中加入供体胞苷5’-单磷酸-N-乙酰神经氨酸，在α2，6唾液酸转移酶的催化下生成带有Fmoc-Gly连接的ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物6，即得所述ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物。

2.如权利要求1所述ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的合成方法，其特征在于：所述反应生成中间体2，其中，无水二氯甲烷与甲醇体积比为4：1，甲醇钠的含量为0.4％，室温下反应，反应时间为1～2h。

3.如权利要求1或2所述ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的合成方法，其特征在于：所述反应得到中间体3，其中，反应温度为40℃，反应时间为20～26h。

4.如权利要求1所述ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的合成方法，其特征在于：所述反应生成中间体4，其中，反应温度为4℃，反应时间为24～28h，所述中间体3与Fmoc-Gly-OPfp的摩尔比为1：1.2，所述中间体3和吡啶的摩尔比分别为和1：1.1。

5.如权利要求1所述ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的合成方法，其特征在于：所述生成中间体5，其中，反应温度为37℃，反应时间为12h，反应缓冲液为100mMTris-HClpH7.5，其中包含10mM的氯化镁，所述中间体4与供体二磷酸尿甘半乳糖摩尔比为1：10，中间体4与β1，4半乳糖转移酶摩尔比为50：1。

6.如权利要求1所述ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的合成方法，其特征在于：所述生成生物标记物6，其中，反应温度为37℃，反应时间为0.5h，反应缓冲液为100mMTris-HClpH7.5，镁离子不影响α2，6唾液酸转移酶活性，所述中间体5与供体胞苷5’-单磷酸-N-乙酰神经氨酸摩尔比为1：12，中间体5与SiaT摩尔比为50：1。

7.一种抗体，其特征在于：所述抗体，包括权利要求1～6中任一所述的ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物与载体蛋白KLH连接形成糖缀合物进行免疫学试验产生。

8.如权利要求7所述抗体，其特征在于：所述抗体的免疫学刺激产生方法，包括，

步骤一、将Sia-Gal-Gn2GlyFmoc溶于含有10％哌啶的DMF溶液中，在室温条件下，反应1h，脱掉Fmoc基团；

步骤二、减压旋蒸除掉步骤一反应混合物的溶剂，将混合物溶于0.1MpH8.0磷酸盐缓冲液/DMF(1：4，v/v)混合溶剂中，加入双琥珀酰亚胺戊二酸酯DSG，其与Sia-Gal-Gn2GlyFmoc的摩尔比为15：1，在室温下反应3～6h得到Sia-Gal-Gn2Gly-DSG；

步骤三、通过减压旋蒸除去步骤二的反应混合物溶剂，向反应容器内加入0.1MpH8.0磷酸盐缓冲液溶解混合物，紧接着加入与Sia-Gal-Gn2Gly-DSG摩尔比为1：30的载体蛋白KLH，在室温条件下缓慢搅拌反应2.5～3d得到糖缀合物Sia-Gal-Gn2Gly-DSG-KLH；

步骤四、将步骤三反应混合物经过葡聚糖凝胶柱脱盐纯化得到ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物与载体蛋白连接形成的糖缀合物Sia-Gal-Gn2Gly-DSG-KLH，产进行免疫学试验，产生特异性识别生物标记物的抗体。

9.如权利要求7或8中所述抗体在制备体外诊断ALG1-CDG试剂盒中的应用。

10.如权利要求7或8中所述抗体在在制备体外诊断PMM2-CDG试剂盒中的应用。