[发明专利]β-甘露聚糖酶耐热突变体M18、重组菌及其应用

说明书

本发明涉及β‑甘露聚糖酶耐热突变体M18、重组菌及其应用，属于基因工程和酶工程领域，本发明采用蛋白质表面电荷优化策略，理性设计并筛选突变位点，将白曲霉来源的β‑甘露聚糖酶ManAK进行改良，再通过高通量筛选方法挑选正向突变，最终获得热稳定性提高的23株β‑甘露聚糖酶突变体。本发明获得的β‑甘露聚糖酶突变体耐热性是原始基因的1.2～3.5倍，耐热性均有显著提高，有利于实现其在商业中的应用，从而降低生产成本。

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一类β-甘露聚糖酶耐热突变体、重组菌及其应用。

背景技术

甘露聚糖是半纤维素的第二大组分，由吡喃甘露糖通过β-1,4糖苷键连接而成。甘露聚糖的彻底降解需要甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶和脱乙酰酯化酶的协同作用。其中，甘露聚糖酶为降解过程的关键酶。

β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)能通过催化β-1,4甘露糖苷键将甘露聚糖水解为甘露糖和甘露低聚糖。该酶作为一种重要的工业用酶制剂，被广泛应用于动物饲料、食品加工、医药、纺织、生物漂白以及石油等可再生能源领域。其中一些应用领域，特别是饲料制粒、可再生能源生产等过程需要进行高温处理，这就要求所开发的β-甘露聚糖酶具有良好的耐热性能。耐热酶的最适作用温度在60℃以上，较高的反应温度，降低了杂菌的污染，减少了杂菌代谢产物的干扰，可提高酶的催化能力和催化效率，极大降低生产成本。目前，市面上存在的β-甘露聚糖酶耐热性往往达不到工业要求,导致其在生产运输过程中生物活性不稳定，严重限制该酶应用。因此，开发具有优良耐热性的β-甘露聚糖酶具有重要工业意义和经济价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体。本发明通过理性设计，采用蛋白质表面电荷优化策略，通过筛选设计位点，对白曲霉来源的β-甘露聚糖酶ManAK(氨基酸序列SEQIDNO：1，核苷酸序列SEQ IDNO：2)进行改良，得到热稳定性提高的β-甘露聚糖酶单位点突变体。本发明的另一目的是提供了包含上述突变的β-甘露聚糖酶基因的重组载体。将突变得到的β-甘露聚糖酶基因插入到表达载体合适位点，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接，得到重组酵母表达质粒。本发明还提供了包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组菌株，所述菌株为酵母菌。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案:

一种耐热性提高的单位点β-甘露聚糖酶突变体，所述的β-甘露聚糖酶突变体为M7(D97N),是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第97位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；

或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M8(D107N),是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第107位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；

或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M9(D113N),是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第113位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；

或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M10(D123N),是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第123位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；

或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M11(D136N),是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第136位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；

或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M12(D151N),是由氨基酸序列为SEQID NO：1的β-甘露聚糖酶的第151位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；

或者所述的β-甘露聚糖酶突变体为M13(D154N),是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第154位氨基酸天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)获得；