[发明专利]基于DNA四面体的间充质干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种基于DNA四面体的间充质干细胞外泌体制剂，其特征是，所述外泌体制剂是将DNA四面体纳米材料负载于间充质干细胞外泌体表面而得到的外泌体制剂Exo-TDN；或者

所述外泌体制剂是将DNA四面体纳米材料负载于间充质干细胞外泌体后，通过交联剂磷脂聚乙二醇马来酰亚胺，将心肌特异性靶向肽PCM修饰到外泌体表面而得到的外泌体制剂PCM-Exo-TDN；所述DNA四面体纳米材料的四条链的碱基序列为：

S1：GAGCGTTAGCCACACACACAGTC-Cholesterol，

S2：TTAGGCGAGTGTGGCAGAGGTGT-Cholesterol，

S3：CGCCTAAACAAGTGGAGACTGTG-Cholesterol，

S4：AACGCTCACCACTTGAACACCTC；

所述间充质干细胞为人或鼠的间充质干细胞；所述间充质干细胞外泌体为提取的3-5代传代培养细胞的外泌体。

2.权利要求1所述的外泌体制剂的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

（a）取间充质干细胞进行传代培养，得到3-5代传代培养的间充质干细胞；

（b）当间充质干细胞的融合程度达到70-80%时，除去原有的培养基，换成无血清培养基，培养12-24h后，收集上清液，然后进行离心、过滤，提取外泌体；

（c）预先制备DNA四面体纳米材料，然后将间充质干细胞外泌体分散于PBS中，加入制备的DNA四面体纳米材料，在37℃下孵育0.5-3h，其中，间充质干细胞外泌体与DNA四面体纳米材料的质量比为1:2-5，之后迅速放到冰上震荡0.5-2h，最后用超滤离心管进行离心，即得到外泌体制剂Exo-TDN；

（d）取心肌特异性靶向肽PCM、磷脂聚乙二醇马来酰亚胺DSPE-PEG-MAL溶于水中，于2-4℃搅拌过夜，然后转入透析袋中，每3-5h换一次水，透析24-36h后，进行冷冻干燥，得到DSPE-PEG-PCM，取步骤（c）制备的Exo-TDN分散于PBS中，然后加入DSPE-PEG-PCM，于2-4℃搅拌3-5h后，用超滤离心管进行离心，除去未反应的DSPE-PEG-PCM，即得到外泌体制剂PCM-Exo-TDN。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，步骤（b）中，将细胞培养上清液在10000rpm离心20-40min，然后用0.22μm的滤膜过滤，再加入细胞培养上清液1/3体积的外泌体提取试剂，于2-4℃孵育过夜，之后在2-4℃，转速10000g条件下离心20-40min，取沉淀，用PBS重悬，即得到外泌体。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，步骤（c）中，将等摩尔量的四条DNA链在缓冲液中混合均匀，然后在95℃下保持5-15min，然后冷却至4℃，即得到DNA四面体纳米材料。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是，步骤（c）中，所述缓冲液为20mM Tris、16mM MgCl₂、pH8.0。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，步骤（d）中，心肌特异性靶向肽PCM与磷脂聚乙二醇马来酰亚胺DSPE-PEG-MAL的质量比为1:2，透析袋为3500Da透析袋，所述 Exo-TDN与加入的DSPE-PEG-PCM的质量比为1:2，超滤离心的条件为通过100KDa超滤管于2-4℃、转速4500g下离心15-30min。

7.权利要求1所述的外泌体制剂在制备针对肿瘤化疗的解毒修复药物中的应用。