[发明专利]抗体功能化的外泌体制剂及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种抗体功能化的外泌体制剂，其特征是，所述外泌体制剂是以特定的肿瘤抗原Ag激活的树突状细胞的外泌体Exo-Ag为载体，利用磷脂-聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯DSPE-PEG-NHS为交联剂，将抗CD3抗体aCD3和抗EGFR抗体aEGFR修饰到外泌体Exo-Ag表面而得到的外泌体制剂Exo-Ag-aCD3/aEGFR。

2.根据权利要求1所述的外泌体制剂，其特征是，所述树突状细胞为骨髓来源的树突状细胞、DC2.4细胞系、外周血树突状细胞中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的外泌体制剂，其特征是，所述特定的肿瘤抗原Ag为OVA抗原、黑色素瘤相关抗原 MAGE以及通过细胞或组织破碎提取出的黑色素瘤特异性抗原中的至少一种。

4.权利要求1所述的外泌体制剂的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

（a）培养树突状细胞：将保存的树突状细胞进行活化并接种于培养皿中，在含5% CO₂的37℃细胞培养箱中培养；

（b）提取外泌体：将特定的肿瘤抗原Ag与树突状细胞共孵育，孵育完成后，收集细胞培养上清液，利用梯度离心法，除去细胞碎片和大颗粒蛋白杂质，之后利用超滤离心管进行浓缩除杂，得到外泌体溶液Exo-Ag；

（c）抗体修饰Exo-Ag：将磷脂-聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯DSPE-PEG-NHS溶于DMSO中，将经洗涤后的抗体aCD3和抗体aEGFR分别与DSPE-PEG-NHS溶液混合，其中，抗体aCD3或抗体aEGFR与DSPE-PEG-NHS的摩尔比为1∶1-3，混合后在2-4℃条件下持续搅拌反应20-28h；反应完成后离心除去未反应的DSPE-PEG-NHS，分别得到DSPE-PEG-NHS-aCD3溶液和DSPE-PEG-NHS-aEGFR溶液；将DSPE-PEG-NHS-aCD3溶液和DSPE-PEG-NHS-aEGFR溶液与Exo-Ag于 2-4℃条件下反应2-4h，使DSPE-PEG-NHS-aCD3和DSPE-PEG-NHS-aEGFR的DSPE端插入到外泌体的膜磷脂双分子层中，从而得到成功修饰aCD3和aEGFR的外泌体制剂Exo-Ag-aCD3/aEGFR。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是，步骤（a）中，将冻存的树突状细胞取出，在37℃水浴锅内使其融化，然后移入EP管中，加入预热的1640完全培养基，吹匀后进行离心，弃上清液，再加入1640完全培养基，并吹匀后接种于培养皿中进行培养。

6.根据权利要求4所述的制备方法，步骤（b）中，将0.1-0.5 mg/mL 的肿瘤抗原Ag与树突状细胞共孵育12-24h后，更换新鲜培养基48 h后收集细胞培养上清液进行过滤。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是，步骤（c）中，利用10 KDa超滤离心管除去过量的DSPE-PEG-NHS，随后将抗体aCD3和抗体aEGFR的溶液超速离心除去溶剂，并用PBS洗涤并溶解后回收备用。

8.权利要求1-3任一所述的外泌体制剂在靶向抗肿瘤药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征是，所述药物为注射剂，所述药物包含外泌体制剂Exo-Ag-aCD3/aEGFR。