[发明专利]猪鼻支原体外膜蛋白Mhr_0461在制备猪鼻支原体或其抗体检测试剂盒中的应用

说明书

本发明属于动物传染病防治技术领域，公开了猪鼻支原体外膜蛋白Mhr_0461在制备猪鼻支原体或其抗体检测试剂盒中的应用。所述的外膜蛋白Mhr_0461的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。抗原蛋白Mhr_0461为申请人首次发现的猪鼻支原体功能未知的外膜蛋白，具有较好的免疫原性，Mhr_0461具有极高的特异性，为猪鼻支原体所特有，可作为猪鼻支原体或其抗体检测的分子靶标。同时，外膜基因Mhr_0461是成本较低的基因资源，基于其在大肠杆菌表达系统中的高效表达，易于纯化和制备。与全菌作为包被抗原的诊断方法相比，极大地提高了检测的特异性、显著降低了生产成本。

技术领域

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及猪鼻支原体外膜蛋白Mhr_0461在制备猪鼻支原体或其抗体检测试剂盒中的应用。

背景技术

猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis,Mhr)属于原核生物界-软壁菌门-柔膜体纲-支原体目-支原体科-支原体属，是一种无细胞壁、能够进行自我复制的原核微生物。猪鼻支原体最初由Carler和Mckay在1953年从传染性萎缩性鼻炎猪的呼吸道中分离得到，该病原主要通过飞沫和直接接触传播，感染率极高，普遍存在于病猪的鼻腔、气管和支气管分泌物中。猪鼻支原体感染可引起多发性浆膜炎、关节炎、肺炎等症状，常与其他病原混合感染，加大疾病的复杂程度和治疗难度，给养殖业造成巨大的经济损失。

近年来研究发现猪鼻支原体可从人胃癌组织中检测和直接分离得到，进一步发现Mhr的感染与胃癌、肺癌、胰腺癌、大肠癌、前列腺癌等多种癌症有明显的相关性，提示Mhr与肿瘤的发生相关，对人类的健康构成了威胁。猪鼻支原体与肿瘤发生的高度相关性引起了人们的广泛关注。然而，猪鼻支原体的研究相对滞后，对其感染、致病以及免疫学状况还知之甚少。目前，国内尚没有猪鼻支原体的诊断试剂盒，无法满足Mhr防控的需求，因此迫切需要甄选出适用于猪鼻支原体特异性诊断的分子靶标，开发出特异、敏感的检测试剂盒。

因此，申请人以猪鼻支原体为研究对象，结合比较基因组学、生物信息学、菌落原位免疫印迹(人工感染的猪鼻支原体阳性血清作为一抗)、Western Blot和iELISA方法，最终筛选到了猪鼻支原体特有的外膜蛋白Mhr_0461，并成功将其作为猪鼻支原体血清学检测的分子靶标，以求获得更特异的成本更低的基因资源。

发明内容

本发明的目的在于提供猪鼻支原体外膜蛋白Mhr_0461在制备猪鼻支原体或其抗体检测试剂盒中的应用，所述的猪鼻支原体外膜蛋白Mhr_0461的氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

申请人以猪鼻支原体基因组为研究对象，使用BLAST和tBLASTn程序，将其基因组上的所有基因比对至其他支原体基因组中，采用双向比对方法获得高得分配对(HSP)组(条件设为：相似度和序列覆盖率80％，E-value＝1e-4)。随后通过Inparanoid程序和tribeMCL方法对同源基因进行聚类分析，筛选到71个猪鼻支原体特有基因，并利用TMHMM Serverv.2.0和菌落原位免疫印迹方法(人工感染制备的猪鼻支原体阳性血清作为一抗)对特有基因的跨膜特性和免疫原性进行初步筛选，并用Western Blot和iELISA进一步评估猪鼻支原体特有候选基因的免疫原性和交叉反应性，最终筛选到了猪鼻支原体特有的外膜基因Mhr_0461，该基因与其余支原体中基因均不具有同源性，是适用于猪鼻支原体检测的特异性分子靶标，该基因编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。

经检测，所述的蛋白具备免疫原性和特异性，原核表达时，蛋白表达效率高，可用于制备猪鼻支原体抗体的检测试剂盒；本发明的Mhr_0461蛋白还可作为抗原制备单抗或者多抗，用于猪鼻支原体的检测。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、抗原蛋白Mhr_0461为申请人首次发现的猪鼻支原体外膜蛋白，为具有免疫原性蛋白。