[发明专利]生产β-烟酰胺核糖的重组微生物及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种生产β‑烟酰胺核糖(NR)的重组微生物及其构建方法与应用，属于生物技术领域。本发明首次发现核糖核苷水解酶RihA或RihB在调节β‑烟酰胺核糖产量中的应用。基于上述发现，本发明制备了一种生产β‑烟酰胺核糖的重组微生物，所述的重组微生物包含以下一个或几个特征：(1)编码核糖核苷水解酶的基因缺失、失活或活力降低，或核糖核苷水解酶的含量或活力降低；(2)过表达水解磷酸基团或者水解核苷的编码基因。采用本发明所述的重组微生物以β‑烟酰胺单核苷酸(NMN)为底物生产NR，可有效提高NR的产量，减缓NR的降解，降低反应的副产物，可用于β‑烟酰胺核糖的大规模工业化生产。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生产β-烟酰胺核糖的重组微生物及其构建方法和应用。

背景技术

β-烟酰胺核糖(NR，Nicotinamide riboside)是维生素B3的一种衍生物，它是合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)等的一种前体物质。NR在烟酰胺核苷酸激酶(NRKs)的作用下磷酸化后转化为NMN然后进一步转变为NAD。研究表明，在酵母、哺乳动物以及体外培养的人体细胞中，补充NR能提高NAD水平和活性。NAD在体内一直处于消耗和生成的动态平衡中，NAD作为细胞内重要的信号分子调控着一些依赖于NAD的去乙酰化酶，包括多聚ADP核糖聚合酶(PARPs)和sirtuins长寿蛋白家族sirtl-7(Sir2的同源基因)，广泛参与机体的生长发育、细胞凋亡、炎症、肿瘤、血管生成、神经退行性病变和细胞能量代谢等重要生命活动。另有研究表明，NR可存在于牛奶中作为NAD的重要膳食来源，但尚未在膳食中发现NMN，并且NMN在血清中的存在形式仍存在争议，因此，研究者提出NR可能是NAD前体的重要存在形式，因而能够通过饮食调节NAD的水平。

目前生产NR的方法主要为化学合成法，如利用三氟甲磺酸三甲基硅脂(TMSOTf)实现反应，虽然该方法产率高，但是即使产物构型的选择性高，也难以避免产生无任何用途的α-烟酰胺核糖，同时残留的三氟甲磺酸离子会影响产物作为食品食用，无法高效实现工业化生产；还有用四氯化锡为催化剂替代三氟甲磺酸三甲基硅脂，虽然得率高，操作简单，但是无法实现立体选择性得到β-构型的烟酰胺核糖，最终的产品无法满足相关的品质要求。因此其化学合成法普遍存在工艺反应时间长，检测困难，质量可控性差，产物纯化难度大等问题。

重组微生物发酵法生产NR，主要是利用微生物菌株自身的生物合成途径来生产NR，避免使用化学试剂给后期纯化带来困难，其优势在于以糖质为原料，产品绿色，生产成本低、效益高，特别是目前基因工程育种技术及高产优化控制技术的采用，使发酵法生产成本大大降低；酶催化法生产NR，即利用特定功能的酶，以NMN作为底物，在特定条件下，催化反应生成NR，整个反应条件温和，转化效率高，更有利于提高NR产品的纯度和含量。

目前已有利用重组微生物发酵法生产NR的文章和专利报道，但在这些报道中NR的发酵单位都很低，如CN201680078334.8专利中，通过在不同菌株中(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌)过表达不同来源的NaMN酰胺化酶NadE，利用微生物自身代谢途径生产NR，产量仅在0.1-100mg/L左右。而在这些报道中对微生物中NMN和NR的代谢途径尚未完全解释清楚，仅仅简单的过表达一些催化基因，并没有去除支路降解或者利用基因，这是NR产量低的主要原因。

核苷水解酶(nucleoside hydrolase)，是一种能分解核苷生成含氮碱和戊糖的酶。例如大肠杆菌可合成数种核苷水解酶，如RihA、RihB和RihC(Petersen 2001)，分别由rihA、rihB和rihC三个基因编码得到氨基酸序列为311aa、313aa和301aa的蛋白，研究表明，RhiA、RihB和RihC可以水解各种核苷生成相应的嘌呤或嘧啶与核糖。研究表明，RhiA、RihB和RihC可以水解尿苷和胞苷，但还未有相关研究表明RhiA、RihB和RihC与NR的合成和降解代谢有关。