[发明专利]褐藻胶裂解酶AlyPL17、截短体及其应用

说明书

本发明公开一种褐藻胶裂解酶AlyPL17及其截短体，并进一步将AlyPL17及其截短体的基因克隆转化到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达的大肠杆菌重组菌株，用该菌株异源表达相应的褐藻胶裂解酶。酶学性质表征结果表明，AlyPL17及其截短体的最适温度45℃，最适pH为9.0,并且该酶拥有较高的比活力。从作用模式上来看该酶的全酶AlyPL17采用混合作用模式，而两端截短体采用内切作用模式，表明该酶的独特作用模式是由两端截短体协同作用造成的。本发明对解析混合作用模式褐藻胶酶具有极大的参考价值，且所获得的褐藻胶裂解酶AlyPL17可作为褐藻资源向生物能源转化的潜在工具。

技术领域

本发明属于基因工程技术与蛋白表达领域，具体涉及一种褐藻胶裂解酶基因的克隆表达及其固定化。

背景技术

全球能源日益紧张，生物质能源成为研究的热点。玉米等粮食作为第一代生物质资源在大规模应用的同时会带来粮食短缺等问题。而秸秆木质素等第二代生物质资源，由于结构复杂，难以利用在一定程度上限制了其工业化应用。海洋藻类具有分布广泛、不需要淡水资源、不与人争粮食、组成成分中含有可发酵糖类的特点，因此，海洋藻类正逐渐成为第三代生物质资源。

褐藻胶作为褐藻细胞壁的主要成分，是由β-D-甘露糖醛酸(M)以及它的C5差向异构体α--L古罗糖醛酸(G)两种单体组成的酸性多糖。褐藻胶裂解酶可以通过消除反应将其降解成不饱和单糖以及寡糖。根据序列相似性来看，褐藻胶裂解酶可以划分到12个多糖裂解酶家族，即PL5、PL6、PL7、PL14、PL15、PL17、PL18、PL31、PL32、PL34、PL36以及PL39家族。根据底物特异性来分褐藻胶裂解酶可以分为polyM专一型褐藻胶裂解酶、polyG专一型褐藻胶裂解酶以及双功能酶。根据降解模式来分，褐藻胶裂解酶可以分为内切型褐藻胶裂解酶，采用这种作用模式的褐藻胶裂解酶将褐藻胶多糖降解成寡糖。外切型褐藻胶裂解酶，采用这种作用模式的褐藻胶裂解酶可以将褐藻胶降解成不饱和单糖。不饱和单糖可以通过一系列降解过程之后被微生物利用代谢产乙醇。因此将褐藻资源转化成生物能源最关键的一步就是将褐藻胶降解成不饱和单糖。

目前已经得到表征的外切型褐藻胶裂解酶的活性在20-40U/mg之间，单糖转化率较很低。这种情形限制了褐藻胶的生物能源转化。因此，挖掘具有较高活性的外切型褐藻胶裂解酶，并且解析其作用模式具有十分重要的意义。

发明内容

发明目的：本发明的一个目的在于提供一种具有较高活性的外切型褐藻胶裂解酶。

本发明的另一个目的在于提供上述褐藻胶裂解酶的截短体，并对该褐藻胶裂解酶的独特混合作用模式进行解析。

本发明还要解决的问题在于提供上述褐藻胶裂解酶及其截短体的编码基因及应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种褐藻胶裂解酶AlyPL17，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，共695个氨基酸残基。本发明的褐藻胶裂解酶AlyPL17来源Pedobacter hainanensis NJ-02(该菌株信息公开于B.Zhu,et al.,Int.J.Biol.Macromol.(2017)中)。

上述褐藻胶裂解酶AlyPL17，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，为2085bp。

本发明进一步提出了褐藻胶裂解酶AlyPL17的截短体AlyPL17-N，截短体AlyPL17-N是由全酶截取N端结构域1-346共346个氨基酸序列构成的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提出了褐藻胶裂解酶AlyPL17的截短体AlyPL17-C，截短体AlyPL17-C是由全酶截取C端结构域347-695共349个氨基酸序列构成的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。