[发明专利]一种促进大肠杆菌周质表达单域抗体的方法

说明书

本发明公开了一种促进大肠杆菌周质表达单域抗体的方法，属于生物抗体表达技术领域。在诱导表达前对转化有单域抗体基因的大肠杆菌进行0℃冰激处理，处理5‑10min，然后利用低剂量IPTG诱导菌种表达，10‑22℃低温培养，获得大肠杆菌周质表达的单域抗体。本发明所述方法能够将单域抗体表达正确定位于周质空间，克服大肠杆菌在定向周质表达重组单域抗体时无法正确分泌而堆积在胞内的缺陷，同时，该方法还能够有效促进单域抗体在大肠杆菌周质空间中以单体可溶形式高效表达，从而使后续抗体纯化和应用易于实现。

技术领域

本发明属于生物抗体表达技术领域，具体涉及一种促进大肠杆菌周质表达单域抗体的方法。

背景技术

软骨鱼(包括鲨鱼、鳐等)和骆驼科(包括单峰驼、双峰驼、羊驼等)动物的血清中存在着仅由重链组成的抗体，其轻链天然缺失。由于缺乏轻链，这种特殊的抗体起到抗原识别和结合作用的只有重链可变区(在软骨鱼类动物中称为VNAR，在驼类动物中称为VHH)。

为发挥识别和结合抗原的作用，在体外将这种重链可变结构域进行重组表达，形成单域抗体(Single domain antibody)。单域抗体不仅与常规抗体一样具有良好的抗原识别与结合能力，而且还具有如下优势：(1)分子量小，作为目前已知具有完整抗体功能的最小分子片段，其组织渗透性高；(2)亲水性佳；(3)稳定性强，能耐受苛刻的温度和pH条件；(4)更加灵活的铰链区，没有轻重链可变区的错配，使多价抗体的产生更容易；(5)无需糖基化修饰，更加适合细菌表达体系，易于大量制备；(6)具有更长的抗原互补决定区(CDR)，可以结合到常规抗体无法接触到的抗原缝隙或凹陷表位。受限于培养条件，目前鲨鱼来源的单域抗体研究和应用均较少，有着广阔的开发前景。

大肠杆菌作为传统生物学模式生物之一，因其易于培养，遗传背景透彻，是实验室表达异源蛋白的首选生物。大肠杆菌的细胞壁薄但结构复杂，外膜与细胞膜之间存在周质间隙。根据表达的部位，将外源蛋白表达形式分为三种：(1)胞外分泌表达；细菌将异源蛋白分泌到培养基中，但仅适用于小分子蛋白，且在实验室中不利于纯化；(2)胞质表达；其表达量较大，但细菌胞内为还原性环境，含有二硫键的蛋白质往往不能正确折叠并形成二硫键，最终容易大量形成无生物功能的包涵体；虽然有些研究从变性复性的角度尝试恢复包涵体蛋白质的活性，但其工艺繁琐复杂，复性率低，难以进行大批量的处理；(3)周质表达；周质空间呈现氧化性环境，当中含有促进蛋白质折叠的分子伴侣和帮助二硫键正确形成的酶，不仅利于蛋白质中二硫键的形成还可以增加蛋白质的溶解性；另外，在周质空间当中蛋白酶含量较低，杂蛋白少，不仅有利于异源蛋白的稳定存在和下游纯化，而且能减少异源蛋白对于宿主菌的毒性和代谢负担。

目前鲨源单域抗体的表达方法不够成熟，在实际生产应用中，周质表达水平与质粒和目的蛋白本身特性有很大的关系，常常会出现如下问题：

(1)许多单域抗体在大肠杆菌中无法正确表达，或是表达量很低，无法进行后续的应用；

(2)部分单域抗体虽然能够在胞内表达，但大量形成二聚体或多聚体，或无生物功能的包涵体，无法进行后续应用。

(3)设计定位于周质空间的单域抗体虽然有所表达，但是无法正确分泌至细菌周质，反而堆积在胞内。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种使单域抗体在大肠杆菌周质空间以单体可溶形式高效表达的方法；且该方法克服了大肠杆菌在定向周质表达重组单域抗体时无法正确分泌而堆积在胞内以及表达量低无法分离纯化的缺陷。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种促进大肠杆菌周质表达单域抗体的方法，步骤如下：

(1)将转化有单域抗体基因的重组大肠杆菌培养至OD₆₀₀为1.0-1.2；

(2)对步骤(1)中的重组大肠杆菌进行0℃冰激处理，处理5-10min；