[发明专利]一种一步法构建DNA纳米球的试剂盒和方法有效
| 申请号： | 202110685550.1 | 申请日： | 2021-06-21 |
| 公开（公告）号： | CN113249457B | 公开（公告）日： | 2021-10-29 |
| 发明（设计）人： | 谢珍;曾志鹏;张鹏;邢宽 | 申请（专利权）人： | 南京实践医学检验有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6869 | 分类号： | C12Q1/6869 |
| 代理公司： | 南京瑞华腾知识产权代理事务所(普通合伙) 32368 | 代理人： | 邱欢欢 |
| 地址： | 210000 江苏省南京市江北新区新锦湖路3-1号中丹*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 一步法 构建 dna 纳米 试剂盒 方法 | ||
1.一种一步法构建DNA纳米球的试剂盒，其特征在于：由R1、R2和R3组成，其中，
R1为DNB制备缓冲液；
R2为DNB聚合酶缓冲液、DNB聚合酶混合液；
R3为DNB终止缓冲液；
所述DNB制备缓冲液为50-80mM乙酸钾、10-20mM乙酸镁、20-50mM Tris-乙酸、0.1-0.3mg/ml BSA、1-10mM DTT、1-5μM寡聚核苷酸1、1-5μM寡聚核苷酸2、0.01-1μM寡聚核苷酸3、1-5μM寡聚核苷酸4；
所述DNB聚合酶缓冲液为1-10mM乙酸钾、5-20mM乙酸镁、10-40mM Tris-乙酸、0.1-0.3mg/ml BSA、1-5mM DTT、1-5mM ATP和1-5mM dNTP；
所述DNB聚合酶混合液为phi29 DNA Polymerase、T4 DNA Ligase、焦磷酸酶和单链结合蛋白；
其中，所述单链结合蛋白为T4 Gene32 Protein、E.coli SSB；
所述DNB终止缓冲液为EDTA，其浓度为100mM-500mM；
所述寡聚核苷酸1其序列如SEQ ID NO.1所示：5´-GCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGG-3´；所述寡聚核苷酸2其序列如SEQ ID NO.2所示：5´-GAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3´；所述寡聚核苷酸3其序列如SEQ ID NO.3所示：5´-AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA-3´；所述寡聚核苷酸4其序列如SEQ ID NO.4所示：5´-CAACTCCTTGGCTCACA-3´；
其中，四个寡聚核苷酸的3´端最后两个核苷酸之间的连接键进行硫代磷酸化修饰；
所述DNA纳米球的构建方法，包括以下步骤：
（1）将构建好的dsDNA文库与所述DNB制备缓冲液充分混匀；
（2）经过高温变性及低温退火后，寡聚核苷酸结合在ssDNA文库上；
（3）退火产物与所述DNB聚合酶缓冲液、DNB聚合酶混合液轻轻吹打混匀；在低温下，ssDNA同时发生环化和滚环扩增；
（4）滚环扩增产物用DNB终止缓冲液终止，即得到测序用DNA纳米球；
所述Phi29 DNA Polymerase的工作浓度为0.1-1U/μl，T4 DNA Ligase的工作浓度为0.1-0.5U/μl，焦磷酸酶的工作浓度为5-50ng/μl，T4 Gene32 Protein的工作浓度为0.1-0.5U/ml，E.coli SSB的工作浓度为0.1-0.5U/ml。
2.根据权利要求1所述的一种一步法构建DNA纳米球的试剂盒，其特征在于：所述高温变性的温度为95℃-99℃，所述低温退火的温度为20℃-40℃。
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