[发明专利]一种基于CRISPR-Cas12a技术的HEV特异crRNA、检测试剂盒及其应用

说明书

本发明提供了一种基于CRISPR‑Cas12a技术的HEV特异crRNA、检测试剂盒及其应用，属于戊型肝炎病毒(HEV)检测技术领域。本发明提供了基于CRISPR‑Cas12a技术的HEV特异crRNA包括四条g RNA。实验表明crRNA中四条gRNA能够特异性靶向特定的四种基因型的HEV，具有较高的结合特异性。本发明提供检测HEV试剂盒包括HEV特异crRNA、CRISPR‑Cas12a蛋白酶和单链DNA报告系统。本发明将等温扩增技术与CRISPR‑Cas12a技术相结合。该方法检测限可达10copies/μl，且特异性良好，为临床诊断和实验室研究提供了一种准确、快速、简便的检测手段。

技术领域

本发明属于戊型肝炎病毒的基因检测技术领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas12a技术的HEV特异crRNA、检测试剂盒及其应用。

背景技术

戊型肝炎(Hepatitis E，HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)引起的急性病毒性肝炎，简称戊肝。戊型肝炎的传播方式、临床表现和预后均与甲型肝炎(Hepatitis A，HA)类似，不同之处在于，HEV主要侵犯青壮年，65％以上发生于16～19岁年龄组，儿童感染表现亚临床型较多，其成人病死率高于甲型肝炎，尤其孕妇患戊型肝炎病情较重，在妊娠的后三个月发生感染的病死率高达20％。HEV主要通过粪口途径传播，被污染的食物和水源可引起散发或暴发流行。HEV不仅可以感染人类，在动物中也广泛存在与传播。据世界卫生组织(WHO)的数据显示，HEV感染已经成为全球范围内的公共卫生问题。

HEV为呈二十面体对称的球状病毒颗粒，无包膜，表面粗糙，有突起和缺刻，平均直径为27～34nm，其在胞浆内装配，呈晶格状排列，可形成包涵体。HEV是一种单股、正链RNA病毒，共分为4个基因型(HEV 1～HEV4)，其基因组全长约7.2kb，5′端有帽子结构，3′端有polyA尾，编码区包含有3个开放阅读框(Open reading frame，ORF)，在编码区前后又有长度分别为25nt和65nt的非编码区。

最初对戊肝主要是根据病人的临床表现结合流行病学特征加以诊断，随着对HEV研究的不断深入及检测技术的持续发展，近几年已经建立了诸如荧光定量PCR，ELISA，免疫电镜等一系列实验室诊断方法，在对戊肝的精确诊断中发挥了巨大作用。但是这些技术有其各自的局限，如操作门槛高，依赖大型设备，灵敏度特异性不足等。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于CRISPR-Cas12a技术的HEV特异crRNA，所述crRNA能特异性靶向HEV的四个基因型，便于后续四种基因型的HEV的检测。

本发明的目的还在于提供一种基于CRISPR/Cas12a系统的HEV检测试剂盒及其应用，能够实现同时对HEV的四个基因型检测，且具有较高的检测灵敏度，且操作简便。

本发明提供了一种基于CRISPR-Cas12a技术的HEV特异crRNA，所述HEV特异crRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示的g RNA。

本发明提供了一种基于CRISPR-Cas12a技术检测不同基因型HEV的试剂，包括所述HEV特异crRNA和CRISPR-Cas12a蛋白酶。

优选的，还包括单链DNA报告系统。

优选的，所述单链DNA报告系统包括5'端标记荧光基团同时3'端标记荧光淬灭基团的单链核苷酸。

优选的，所述单链DNA报告系统包括5'-6FAM-TTATTT-BHQ1-3'、5'-6FAM-TTATTT-TRAMA-3'或5'-HEX-TTATTT-IABkFQ-3'。

本发明提供了所述HEV特异crRNA或所述试剂在制备检测HEV的试剂盒中的应用。