[发明专利]大型质粒DNA的纯化方法

说明书

本发明公开一种大型质粒DNA的纯化方法，包括以下步骤：S1：向含大型质粒DNA的上清液中加入磷酸盐至浓度为10～50mM，并调节溶液电导率为82～89mS/cm(25℃)，得到上样溶液；大型质粒DNA是指大于20KB的质粒DNA；S2：将上样溶液上样至Poros HQ阴离子层析进行洗脱，收集洗脱液。本发明的方法能够有效而稳定地将大型质粒DNA从大肠杆菌裂解中和后的上清液中纯化出来，可用于大规模GMP生产。

技术领域

本发明属于生物技术领域中，特别是涉及一种用于大型质粒DNA（大于20KB）的纯化方法，通过添加特定浓度范围的磷酸盐，显著提高大型质粒DNA与杂质RNA间的分辨度，从而提高此工艺方法的纯化效果和工艺稳健性。

背景技术

大型质粒DNA（大于20KB）的生产流程通常为对含大型质粒DNA的细菌进行碱液裂解、酸性中和、对中和后的悬浮混合物进行过滤，得到含大型质粒DNA的滤液（或称为上清液）。通过碱裂解法从大肠杆菌中分离质粒DNA时，得到的上清液中剩下的主要多核苷酸是质粒DNA和RNA。这两者均为强酸性（pKa~2），因此，在生理pH下带负电。本领域需要一种高效的AEX阴离子色谱法用于纯化该上清液，以分离质粒DNA和RNA，从而得到高纯度的质粒DNA。

色谱层析法（Chromatography）用于质粒DNA的纯化自90年代起就有较大的发展，包括尺寸排阻式、反相式、二氧化硅介质。这几种方法涉及到使用溶剂（乙醇、异丙醇），有毒化学品（氯化铯、溴化乙锭、苯酚、氯仿）等不推荐的化学物质，去除关键杂质如染色体DNA、RNA、蛋白质和内毒素的效果通常不足，或者主要适合生产少量质粒DNA供实验室使用， 不适合用于治疗性药物相关的质粒DNA的大规模生产。而阴离子色谱法，基于其疏水作用和羟基磷灰石介质，不涉及溶剂的使用，适合于大规模生产。

但是，基于DNA和RNA在分子一级结构上的高度相似性，对DNA与RNA的分辨，主要在于DNA是双链结构，其疏水性的碱基配对向内，而亲水性的磷酸基向外，与RNA的单链结构相比，DNA分子由于磷酸基在外围，其整体的亲水性和负电性略高于RNA分子。到2000年初，Alex Eon-Duval等对阴离子色谱法进行了系统的研究，发现有好几种阴离子层析的介质(Fractogel EMD DEAE, Q Sepharose FF, POROS 50HQ and Ceramic Hyper D)，可以将质粒DNA与RNA分离。需要指出的是，在这个研究中，使用了一个5.9KB的质粒DNA作为代表性质粒分子。对较大的质粒DNA，如10KB以上的，没有进行研究。而大分子DNA，尤其是 5 KB，具有高负电性，更容易受到机械剪切作用，并且溶液中的流体动力学和流动性较慢，因此使其最佳分离非常成问题。同时，这些质粒的大尺寸使其在分离和纯化过程中，与搅拌相关的流体动力剪切应力，如离心，泵送，过滤，喷雾干燥，小瓶填充和雾化都足以降解DNA，导致生物活性的降低。

在2013，Ongkudon等报告了一种新型圆锥形整体柱 (conical monolithcolumn)，可一步分离25 KB的质粒DNA，并消除壁通道（wall channeling）的有效方法。其优点是柱体几乎没有阻力，单片色谱柱的孔径大，易于吸附大分子DNA，实现快速分离，较低的操作压力以及最小的超螺旋DNA的损失。 缺点是这些整体式色谱柱通常由易收缩的聚合物制成，整体树脂与树脂之间会形成缝隙或“壁通道”。这个问题，在扩大规模生产时尤为明显，不适合于大规模生产。

在2017年和2021, Franco-Medrano和Moreir分别报道了使用AEX阴离子膜对DNA纳米疫苗 (nanovaccine) 和慢病毒质粒载体（lenti vector）两种较大的质粒DNA进行纯化，其效果虽好，但AEX阴离子膜价格较高，再生重复使用的效果不好，滤膜的规格尺寸有限，也不适合于大规模的生产。