[发明专利]用于检测新型鹅呼肠孤病毒的引物、试剂盒及其检测方法与应用

说明书

本发明公开了用于检测新型鹅呼肠孤病毒的引物、试剂盒及其检测方法与应用，所述新型鹅呼肠孤病毒检测引物对和探针均靶向新型鹅呼肠孤病毒的λC基因。新型鹅呼肠孤病毒检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明中的新型鹅呼肠孤病毒(NGRV)检测引物对和探针特异性强，灵敏度高，最低可检测限为56.6个拷贝，且检测方法操作简单，重复性好，可以快速、准确、高通量地进行定量分析，有利于在临床实践中推广应用。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及用于检测新型鹅呼肠孤病毒的引物、试剂盒及其检测方法与应用。

背景技术

近年来，随着水禽养殖业的规模化和产业化发展，水禽养殖密度不断提高，但饲养管理水平却相对落后，使得在规模化水禽养殖中容易出现各种病原在不同宿主之间交叉感染的情况。此外，由于部分水禽是多种病毒共同的天然携带者和储存宿主，这也就加剧了水禽疫病呈现复杂性和多样化的问题，从而导致老病出现新的症状或者突然爆发新发传染病的情况。

2020年以来，部分鹅繁育及养殖地区出现了以肝脾点状白色灶性坏死为主要病变特征的传染性疾病，经病原分离鉴定和序列测定，其被命名为新型鹅呼肠孤病毒(NGRV)，但其全基因组序列并未有相应的公开。

相关技术中，用于检测水禽源呼肠孤病毒病原的方法主要有：病毒分离鉴定、琼脂扩散试验、普通PCR以及荧光定量PCR等。但目前并未有能够有效针对新型鹅呼肠孤病毒的快速检测方法，且目前对于该病毒在水禽群体中的流行情况尚未明确，因此，提供一种可靠、有效、快速的用于检测临床样品中新型鹅呼肠孤病毒的方法，对新型鹅呼肠孤病毒病的监测、流行病学调查和防控具有重要意义。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于检测新型鹅呼肠孤病毒的引物、试剂盒及其检测方法与应用，用于检测新型鹅呼肠孤病毒的引物、试剂盒及其检测方法能够精确的检测出待测样品中的新型鹅呼肠孤病毒，其特异性强，灵敏度高，对新型鹅呼肠孤病毒病的监测、流行病学调查和防控具有重要意义。

本发明的第一个方面，提供新型鹅呼肠孤病毒(NGRV)检测引物和/或探针，

所述新型鹅呼肠孤病毒检测引物用于扩增新型鹅呼肠孤病毒特异性基因片段；

所述探针靶向新型鹅呼肠孤病毒的λC基因。

发明人发现，新型鹅呼肠孤病毒(NGRV)与其它水禽源呼肠孤病毒核苷酸的同源性为27.5％～97.3％，进一步进行系统发育分析可知，NGRV病毒株与其它水禽源呼肠孤病毒聚集在同一分支上，其中，NGRV的μA、μB、σB、σC、σNS基因与番鸭呼肠孤病毒(MDRV)ZJ2000M位于同一分支；μNS、λB基因与欧洲GRV分离株D20/99处于同一分支；λA、σA基因则与新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)的遗传距离更近；而λC则位于相对独立的分支中，但仍与NDRV聚集在同一大分支中。因此，可以判断得到，NGRV可能是由不同的水禽源呼肠孤病毒重组产生，因此，其鉴定难度相较于已知的水禽源呼肠孤病毒难度更大。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述新型鹅呼肠孤病毒检测引物对的核苷酸序列为：

上游引物F：5’-CTACGCATTCTTATGAAGTC-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物R：5’-GCAACTACCAAGAGAAAC-3’(SEQ ID NO.2)。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述探针的核苷酸序列为：

探针P：5’-ACTATCGCTACTGTCACCGCC-3’(SEQ ID NO.3)。