[发明专利]一种指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的构建方法和应用

权利要求书

1.一种指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

构建特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼，该特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼中能够共表达EGFP-LC3；

构建特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼，该特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼中能够共表达mRFP-EGFP-LC3。

2.根据权利要求1所述的一种指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，利用tol2转座子系统构建特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼，或构建特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼。

3.根据权利要求1或2所述的一种指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，构建荧光蛋白EGFP和自噬相关蛋白LC3共表达的载体，然后基于该载体获得特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼。

4.根据权利要求1或2所述的一种指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，构建荧光蛋白EGFP、荧光蛋白mRFP和自噬相关蛋白LC3共表达的载体，然后基于该载体获得特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼。

5.根据权利要求1或2所述的一种指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，使用斑马鱼myl7启动子在斑马鱼心肌细胞中表达荧光蛋白EGFP和自噬相关蛋白LC3；或，

使用斑马鱼myl7启动子在斑马鱼心肌细胞中表达荧光蛋白EGFP、荧光蛋白mRFP和自噬相关蛋白LC3。

6.根据权利要求1所述的一种指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼中，EGFP融合自噬相关蛋白LC3标记自噬小体；

特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼中，mRFP融合EGFP-LC3标记自噬小体和自噬溶酶体。

7.基于权利要求1所述构建方法获得的指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的应用，其特征在于，所述指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型在自噬相关的心脏病机制研究、药物测试或治疗方法筛选中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，利用所述指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型，活体检测斑马鱼心肌细胞自噬水平和自噬流情况，包括以下步骤：

(1)构建特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼，以及构建特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼，

(2)斑马鱼幼鱼药物处理及心脏停跳后成像统计分析

使用不同药物处理特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼或特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼幼鱼；

将心脏做停跳处理后进行精细荧光成像，根据荧光成像结果来统计分析心肌细胞的自噬水平或自噬流的情况。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，使用EGFP和mRFP的激光通道对心脏组织进行单层或多层成像；成像图片分别统计自噬小体的数量、密度；或统计自噬小体与自噬溶酶体比率。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，通过统计mRFP、EGFP共表达的信号指示自噬小体的数量和密度，而仅mRFP阳性的信号指示自噬溶酶体的数量和密度，且比较自噬小体和自噬溶酶体的比例分析自噬流进展情况。