[发明专利]一种PCR检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉菌的特异性引物、方法及应用

说明书

本发明公开一种PCR检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉菌的特异性引物，所述特异性引物为两对为包括正向引物D.sp‑29和反向引物D.sp‑485的第一对引物或包括正向引物D.sp‑140和反向引物D.sp‑506的第二对引物，其序列分别为D.sp‑29：5′‑CCCTTTGTGAACTTATACCTT‑3′；D.sp‑485：5′‑CAGGGCACCGCCAGGGCCTTCCAG‑3′；D.sp‑140：5′‑TTGTTTTTACACTGAAACTCTG‑3′D.sp‑506：5′‑AAGTTGGGGGTTTAACGGCA‑3′；利用这种特异性引物的PCR检测方法，可以快速检测猕猴桃中拟茎点霉属的存在，检测准确度和特异性高，并分别能在接种拟茎点霉菌后早期检测到病原菌。

技术领域

本发明涉及DNA分子标记技术领域，具体涉及一种PCR检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉菌的特异性引物、方法及应用。

背景技术

我国是猕猴桃驯化品种的起源地和野生品种多样性中心，具有得天独厚的丰富自然资源。近年来，猕猴桃产业发展迅速。据2019年7月联合国粮农组织统计，截止到2017年底，我国猕猴桃采收面积和产量均稳居世界第一位，在世界猕猴桃产业发展中都占有举足轻重的地位。

猕猴桃属于呼吸跃变型果实，有明显的生理后熟过程，采后极易变软腐烂，不耐贮藏。猕猴桃软腐病是发生在果实贮藏期的最常见的真菌性病害，发病初期果实外表无明显症状，随着病情发展，发病部位表皮开始变软，微微凹陷，病斑中心果肉呈乳白色，周围果肉呈黄绿色透明状，7天左右果实完全腐烂，并产生刺鼻的气味。猕猴桃软腐病在世界各个主产国，如新西兰，智利，韩国，意大利，伊朗及我国都有过相应报道，最高发病率最高达68％。猕猴桃软腐病分布广，发病快，发病率高，造成严重的经济损失，且有逐年加重的趋势，对猕猴桃产业发展产生严重威胁。

目前报道的猕猴桃软腐病病原菌有葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea，拟茎点霉菌 Phomopsis spp.(有性态Diaporthe spp.)，灰霉菌Botrytis cinerea，链格孢菌Alternaria spp.，青霉菌Penicillium spp.等等，其中葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea和拟茎点霉菌Phomopsis spp.(有性态Diaporthe spp.)为主要致病菌。目前，猕猴桃软腐病病原菌的检测鉴定主要依赖于传统的病原菌分离鉴定，主要包括症状观察、病原菌分离、显微形态观察及分子鉴定等，耗时较长，极不利于猕猴桃软腐病的早期检测及预防。PCR检测是最常用的一种分子生物学检测方法，可通过快速扩增病原微生物的特异性核酸序列，实现病原菌的快速检测，近年来已在传染病、食源性致病菌污染、环境污染、肿瘤遗传标记等领域广泛应用，是比较成熟且应用范围最广的检测技术。但是现有的PCR检测猕猴桃软腐病病原菌的引物特异性不够高，检测的准确度比较低。

鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本发明。

发明内容

本发明的目的在于解决目前没有快速检测猕猴桃软腐病病原的菌拟茎点霉属的特异性引物，现有PCR检测的准确度低、特异性不高的问题，提供了一种PCR检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉菌的特异性引物、方法及应用。

为了实现上述目的，本发明提供一种PCR检测猕猴桃软腐病病原菌拟茎点霉菌的特异性引物，所述特异性引物为两对，第一对引物为正向引物D.sp-29和反向引物D.sp-485，第二对引物为正向引物D.sp-140和反向引物D.sp-506，其序列分别为：

D.sp-29：5′-CCCTTTGTGAACTTATACCTT-3′；

D.sp-485：5′-CAGGGCACCGCCAGGGCCTTCCAG-3′；

D.sp-140：5′-TTGTTTTTACACTGAAACTCTG-3′；

D.sp-506：5′-AAGTTGGGGGTTTAACGGCA-3′。