[发明专利]褪黑激素对子代獭兔毛囊细胞凋亡率影响的研究方法

权利要求书

1.褪黑激素对子代獭兔毛囊细胞凋亡率影响的研究方法，其特征在于，包括如下研究步骤：

1)确定褪黑激素埋植剂量；

2)将实验用兔分为激素埋植组以及不埋植激素的对照组，以在实验用兔产子后，采集子代皮肤组织样本；

3)制作皮肤组织样本的切片；

4)切片的综合处理，以及对细胞凋亡数据的测定。

所述步骤2)中激素埋植组埋植褪黑激素缓释颗粒，不埋植激素的对照组埋植不含激素的硅胶颗粒；

所述步骤3)中切片的制作包括脱水、透明、包埋、切片、摊片和烤片；

所述步骤4)中切片的综合处理包括蛋白酶K修复、破膜、室温平衡、加反应液、DAPI复染细胞核、封片以及镜检拍照。

2.根据权利要求1所述的褪黑激素对子代獭兔毛囊细胞凋亡率影响的研究方法，其特征在于：所述步骤1)中褪黑激素的埋植剂量为10mg。

3.根据权利要求1所述的褪黑激素对子代獭兔毛囊细胞凋亡率影响的研究方法，其特征在于：

所述步骤2)中实验用兔为若干母兔与同一只公兔精液进行人工授精，且在人工授精后诊断出受孕的孕兔作为实验用兔；

所述步骤2)中实验用兔产子后，自激素埋植组以及不埋植激素的对照组中选择数量相一致的窝仔兔，采用颈部移位法进行屠宰，屠宰后立即剥皮，于臀十字部位取2cm边长的方形皮肤块，用生理盐水冲洗后立即放入多聚甲醛溶液中固定。

4.根据权利要求1所述的褪黑激素对子代獭兔毛囊细胞凋亡率影响的研究方法，其特征在于：所述步骤3)中皮肤组织样本的脱水为梯度脱水；

梯度脱水的具体步骤如下：

1)75％乙醇内脱水1小时；

2)85％乙醇内脱水1小时；

3)将95％乙醇分为两组，各组内脱水1小时；

4)将100％乙醇分为两组，各组内脱水45分钟；

5)苯乙醇内脱水45分钟，其中苯乙醇溶液为体积比为1:1的二甲苯和乙醇；

所述步骤3)中皮肤组织样本的透明由二甲苯作用，步骤3)中皮肤组织样本的包埋由石蜡固定；

透明和包埋的具体步骤如下：

1)将二甲苯分为两份，皮肤组织样本置于每份二甲苯内7分钟；

2)其后将皮肤组织样本置于苯蜡中1小时；

3)将石蜡分为两份，皮肤组织样本置于每份石蜡内1小时；

所述步骤3)中皮肤组织样本的切片步骤如下：

石蜡包埋48小时后切片，将蜡块放在切片机上，先按住调平按钮调节刀片和蜡块的间隔以及视点，试切，切片机档位先调到10微米,当切到组织时调至6微米；

所述步骤3)中皮肤组织样本的摊片和烤片步骤如下：

1)切下的组织轻轻放入摊片机中，待皮肤组织彻底展平后，用载玻片将组织捞出；

2)去除剩余的水后放置于烘片机上，进行烘干处理。

5.根据权利要求1所述的褪黑激素对子代獭兔毛囊细胞凋亡率影响的研究方法，其特征在于：

所述步骤4)中蛋白酶K修复的操作步骤下：

1)切片完全甩干前，用组化笔在组织周围画圈，在圈内滴加蛋白酶K工作液覆盖组织，37℃温箱孵育22分钟；

2)将玻片置于pH为7.4的PBS中后在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5分钟；

所述蛋白酶K工作液浓度为原液：PBS＝1：9。

6.根据权利要求1所述的褪黑激素对子代獭兔毛囊细胞凋亡率影响的研究方法，其特征在于：

所述步骤4)中破膜的操作步骤如下：

1)切片完全甩干前，在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20分钟；

2)将玻片置于PBS中后脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5分钟；

所述破膜液为0.1％Triton，即Triton原液：PBS＝1:1000的混合溶液；

所述室温平衡是将未完全甩干的切片，在圈内滴加缓冲液覆盖组织，缓冲液常温孵育10分钟。