[发明专利]一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法

权利要求书

1.一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法，其特征在于：包含以下步骤：

(1)刺葡萄愈伤组织细胞的获取：利用植物组织培养技术，将紫红色刺葡萄愈伤组织细胞培养在固体培养集中培养30～35d，即可获得充分成熟的、富含花色苷的刺葡萄愈伤组织细胞；所述固体培养基为添加了1.0mg/mL2,4-D、30g/L糖、6g/L琼脂粉的MS固体培养基；

(2)刺葡萄愈伤组织细胞的预处理：将步骤(1)获得的刺葡萄愈伤组织细胞从培养瓶中取出，去除培养基，收集刺葡萄愈伤组织细胞，用冷冻干燥法或低温真空干燥法进行干燥，获得刺葡萄愈伤组织细胞干品；短时间保存可以置于4℃冰箱中冷藏，长期保存可置于-40℃或-80℃冰箱中冻存；

(3)制备花色苷提取液：取步骤(2)获得的刺葡萄愈伤组织细胞干品，放入破壁匀浆机中，按提取液体体积与刺葡萄愈伤组织细胞干品重量的提取剂料比为18ml:1g的剂量，加入冷冻酸化70％～75％食品级乙醇，匀浆；匀浆后的提取混合液置于超声仪器中，于35℃～45℃、功率300W～400W、提取时间50min～60min，提取刺葡萄愈伤组织细胞中花色苷；超声结束后，于4℃、转速5000rpm～7000rpm，离心10min～15min，取上清；沉淀按上述操作再次加入适当减量的提取剂提取花色苷，重复2次；最后合并上清液，即得刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液；

(4)花色苷提取液过滤：将步骤(3)获得的刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液，通过0.22μm有机滤膜，进行真空抽滤，抽滤后，获得纯净的刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液；

(5)花色苷提取液浓缩：将步骤(4)获得的纯净刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液转入旋转蒸发瓶中，于35℃～45℃水浴中，避光，进行真空蒸发浓缩，将乙醇与花色苷提取液分离，得到刺葡萄愈伤组织细胞花色苷浓缩液；

(6)花色苷浓缩液检测：检测花色苷浓缩液的质量浓度；

(7)花色苷纯化和洗脱：根据步骤(6)检测的花色苷浓缩液质量浓度，用酸化纯净水将花色苷浓缩液的浓度稀释至0.8～1.0mg/mL，将稀释后的花色苷稀释液通过预处理的弱极性或非极性高分子多孔微球的吸附与洗脱，获得纯化后的含有刺葡萄愈伤组织细胞花色苷的洗脱液；

所述酸化纯净水配制过程如下：取纯净水，用适量的柠檬酸调整纯净水的酸碱度，使纯净水的pH为2.0～3.0；

所述预处理的弱极性或非极性高分子多孔微球的方法如下：将弱极性或非极性高分子多孔微球置于无水乙醇中浸泡24～36h，充分溶胀后湿法装柱，用纯净水冲洗，洗至无醇味；接着用0.05～0.1mol/L盐酸洗至流出液呈酸性后浸泡2～4h，再用超纯水洗至中性；最后用1.0～1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至流出液呈碱性后浸泡2～4h，最后用纯净水洗至中性；

所述吸附与洗脱步骤如下：将刺葡萄愈伤组织花色苷提取液的稀释液，采用恒流泵泵入处理填充好的弱极性或非极性高分子多孔微球中，流速设置为每分钟3～4mL；待稀释液吸附至柱体30％～40％处停止泵入，静置30～40min，使其充分吸附后，用酸化纯净水冲洗3～4个柱体积，充分去除糖等杂质，再用含3％～5％柠檬酸的75％～80％酸化食品级乙醇解吸附，解吸流速设为每分钟5～6mL；当流出液带有红色时，开始收集洗脱液直至颜色消失；

(8)纯化花色苷获取：将步骤(7)获得的纯化花色苷洗脱液，转入旋转蒸发瓶中，于35℃～45℃水浴中，避光，进行真空蒸发浓缩，至不能再蒸发出乙醇为止；获得的蒸发浓缩液预冷冻后，转入冷冻干燥机中，于-45℃～50℃下，真空度15Pa～25Pa，冷冻干燥48～60h，获得纯化花色苷。

2.根据权利要求1所述的一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述刺葡萄愈伤组织细胞冷冻干燥具体步骤如下：将收集的刺葡萄愈伤组织细胞，用液氮迅速冷冻5～6min后，转入冷冻干燥机内，于-45℃-50℃、真空度15Pa～25Pa，冷冻干燥72～80h，取出后，获得刺葡萄愈伤组织细胞干品。

3.根据权利要求1所述的一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述刺葡萄愈伤组织细胞低温真空干燥具体步骤如下：收集刺葡萄愈伤组织细胞，采用低温真空干燥机进行干燥，温度设置为35℃、真空度20～35Pa，将刺葡萄愈伤组织细胞干燥至恒重，获得刺葡萄愈伤组织细胞干品。