[发明专利]基于MIRA技术快速检测霍乱弧菌的方法、引物组、胶体金试纸条及试剂盒

权利要求书

1.一种检测霍乱弧菌的引物组和探针，其特征在于，所述引物组包括上游引物ompW-2-F1和下游引物ompW-2-R1，序列分别为：

ompW-2-F1：CGCGGGTATTGCCTCGGTAGTACCTAATGAC，

ompW-2-R1：ACATATAGCCAAGCGTTAACCCTAACTGG；

所述探针为V.C-ompW-NFO2，其序列为：

AGTAGCGATAAAGTGTTAAACACTCAAAGTGAGTTGGCAGTTAATA。

2.根据权利要求1所述的引物组和探针，其特征在于，所述下游引物ompW-2-R1的的5’端标记一个修饰基团，所述修饰基团为生物素；

所述探针的5'端标记有荧光基团，所述探针的5'端起第30位碱基后插入四氢呋喃THF作为脱碱基位点，所述探针的3'端标记有C3spacer；所述荧光基团选自FAM、Cy3、Cy5、Biotin、FITC中的至少一种。

3.一种检测霍乱弧菌的胶体金试纸条，其特征在于，所述试纸条包括底板以及沿底板的长度方向依次粘附在底板上的样品垫、胶体金垫和吸水垫，且所述样品垫、胶体金垫和吸水垫之间依次与且仅与相邻部位相接触且部分重叠；所述胶体金垫上设置有相间隔的检测线和质控线，所述检测线靠近样品垫，所述质控线靠近吸水垫；所述胶体金垫上喷涂有链霉亲和素，链霉亲和素可作为受体与扩增产物上修饰的生物素结合，所述检测线标记有可与羟基荧光素FAM结合而显色的抗荧光素抗体，所述质控线标记有能与胶体金结合而显色的生物素二抗。

4.根据权利要求3所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述检测线与质控线之间的间距为0.4-0.6cm。

5.根据权利要求1-2任一项所述的引物组和探针、根据权利要求3-4任一项所述的胶体金试纸条在检测霍乱弧菌或制备用于检测霍乱弧菌的试剂盒上的应用。

6.一种用于检测霍乱弧菌的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1-2任一项所述的引物组和探针和/或权利要求3-4任一项所述的胶体金试纸条。

7.一种基于MIRA技术快速检测霍乱弧菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)在反应管中加入上游引物、下游引物、探针和缓冲液，充分混合；

所述上游引物ompW-2-F1序列为：

5'-CGCGGGTATTGCCTCGGTAGTACCTAATGAC-3'(SEQ ID NO.7)，

所述下游引物ompW-2-R1序列为：

5'-ACATATAGCCAAGCGTTAACCCTAACTGG-3'(SEQ ID NO.10)；

所述探针为V.C-ompW-NFO2，其序列为：

5'-AGTAGCGATAAAGTGTTAAACACTCAAAGTGAGTTGGCAGTTAATA-3'(SEQ ID NO.13)；

(2)向步骤(1)所得反应液中依次加入ddH₂O、核酸模板、缓冲液，充分混合后孵育进行反应；

(3)将步骤(2)所得反应液用ddH₂O稀释，混合均匀后将胶体金试纸条的样品垫插入反应液中，观察质控线和检测线，判断结果。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述下游引物ompW-2-R1的的5’端标记一个修饰基团，所述修饰基团为生物素；所述探针的5'端标记有荧光基团，所述探针的5'端起第30位碱基后插入四氢呋喃THF作为脱碱基位点，所述探针的3'端标记有C3spacer；所述荧光基团选自FAM、Cy3、Cy5、Biotin、FITC中的至少一种；

和/或，步骤(1)、(2)中，上游引物、下游引物、探针、核酸模板的摩尔比为10:10:3：25。