[发明专利]抗尼帕病毒G蛋白抗体的间接ELISA检测方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及抗尼帕病毒G蛋白抗体的间接ELISA检测方法。本发明以尼帕病毒G蛋白包被酶标板，利用方阵滴定法确定间接ELISA的最适工作条件，并对该方法的特异性、灵敏性、稳定性等进行分析。本发明成功建立了小鼠血清尼帕病毒G蛋白抗体间接ELISA检测方法，可应用于小鼠血清中抗尼帕病毒G蛋白抗体分析以及疫苗激发的特异性抗体效价的评价研究。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及抗尼帕病毒G蛋白抗体的间接ELISA检测方法。

背景技术

尼帕病毒病作为一种新出现的烈性人兽共患传染病，可导致人类严重且高度致死(致死率40％-70％)，其病原为尼帕病毒(Nipahvirus,NiV)，为单股负链RNA病毒，属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)亨尼帕病毒属(Henipavirus)成员^[1]，NiV能通过直接接触或气溶胶的形式进行传播，导致人或动物感染甚至死亡。该病毒在马来西亚和新加坡的养猪户暴发脑炎后首次发现，随后孟加拉国或印度几乎每年都会暴发脑炎。由于该病毒在尼帕双溪(Sungai Nipah)地区被分离到，因此得名。NiV目前主要有2个遗传谱系：NiV马来西亚株(NiV Malaysia,NiV-MY)和NiV孟加拉株(NiV Bangladesh,NiV-BD)。其中NiV-MY株基因组18246个核苷酸，而NiV-BD株基因组18252个核苷酸，其RNA基因组从3’-5’，由核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合糖蛋白(F)、附着糖蛋白(G)和长聚合酶(L)6个基因连续排列而成，附着在病毒RNA上的N、P和L，形成病毒核糖核蛋白(vRNP)。M、F、G构成病毒粒子的囊膜，其中M与维持病毒形态以及介导病毒出芽有关，而F、G参与介导病毒对宿主细胞的附着与入侵。

自2001年至今几乎每年都在孟加拉国和印度发生致死率超过70％-100％的NiV暴发，而最近一次暴发是在印度克日克德州(Kozhikode)，造成19人感染17人死亡，致死率高达89％，我国与印度接壤，并和孟加拉国邻近，虽然还没有病例报道，但该病具有传入我国的风险。由于该病毒的高致病性、潜在的大流行性，以及目前尚无许可的疫苗与成熟的治疗体系，因此急需研究和开发抗病毒药物和疫苗以及有效的检测方法，以帮助预防和控制未来可能暴发的疫情。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了小鼠抗尼帕病毒(Nipah virus,NiV)G蛋白抗体间接ELISA检测方法。本发明建立了小鼠血清尼帕病毒G蛋白抗体间接ELISA检测方法，为疫苗的后续开发以及特异性抗体的检测与评价奠定了坚实基础。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了抗尼帕病毒G蛋白抗体的间接ELISA检测方法，以尼帕病毒G蛋白作为抗原包被酶标板，拍净液体，洗涤，封闭，洗涤，加入稀释后的一抗孵育，拍净一抗，洗涤，加入酶标二抗孵育，拍净二抗，洗涤，显色孵育，终止反应，获得OD₄₅₀值；

所述一抗包括阳性样本血清或阴性样本血清；

所述抗原的包被浓度为2μg/mL～10μg/mL；所述一抗的稀释度为1：200～1：800；所述一抗的孵育时间为30min～90min。

在本发明的一些具体实施方案中，所述抗原的包被浓度为10μg/mL；所述一抗的稀释度为1：400，所述一抗的孵育时间为60min。

在本发明的一些具体实施方案中，所述酶标二抗的工作浓度为1:5000～1:20000；所述酶标二抗的孵育时间为30min～120min。

在本发明的一些具体实施方案中，所述酶标二抗的稀释度为1︰20000，所述酶标二抗的孵育时间为30min。

在本发明的一些具体实施方案中，所述封闭具体为：以5％脱脂乳-TBST为封闭液，37℃封闭1.5h。