[发明专利]一种促进骨髓间充质干细胞分泌细胞因子的方法

说明书

本发明公开了一种促进骨髓间充质干细胞分泌细胞因子的方法，包括以下步骤：（1）分离骨髓间充质干细胞进行原代培养，在细胞融合度达到80‑90%后，用0.25%胰酶消化；（2）将步骤（1）消化后的细胞用培养基重悬后接种至用羟丙基纤维素和泊洛沙姆188包被的培养瓶中，培养24h后进行半量换液，继续培养过程中每天补充一次培养基，每次补充的培养基中添加丹皮酚、金属硫蛋白‑3、雷帕霉素，连续培养3天，收集培养液。本发明对经原代培养后的细胞采用羟丙基纤维素和泊洛沙姆188包被的培养瓶培养，培养过程中及时补充添加丹皮酚、金属硫蛋白锌、雷帕霉素的培养基，显著的促进骨髓间充质干细胞分泌细胞因子，有利于骨髓间充质干细胞因子的收集和应用。

技术领域

本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种促进骨髓干细胞分泌细胞因子的方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外 胚层。MSC具有自我复制、自我更新、多方向分化潜能、造血支持以及免疫 调控等特性。在特定的机体外分化环境下，能够诱导分化为神经、心脏、骨、软骨、脂肪、上皮等多种组织细胞，被认为是细胞治疗技术的最有希望的来源细胞之一。骨髓间充质干细胞是来源于骨髓来源的间充质干细胞，骨髓间充质干细 具有较强的自我更新我增殖能力以及向分化潜能。骨髓间充质干细胞由于其来源广泛，易于分离培养，并且具有较强的分化潜能和可自体移植等优点，越来越受到学者们的青睐，被认为是不久即将被引入临床治疗的最优干细胞。

除此以外，骨髓间充质干细胞能分泌多种营养物质，包括巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、干细胞因子(SCF)、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-11（IL-11）、白血病抑制因子（LIF）等，这些生长因子可参与多种细胞反应，抑制细胞凋亡、促进细胞生长等，还具有改善炎性环境、调节机体免疫状态、促进伤口愈合等作用，而收集条件培养基是获得这些活性成分的有效方法。目前提高骨髓间充质干细胞细胞因子产量的方法虽然已有研究，但是用于大规模使用的方法还不多，应用场景也不充分，需要进一步的提高。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种促进骨髓间充质干细胞分泌细胞因子的方法，提高了培养液中细胞因子的含量，便于细胞因子的收集和应用。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种促进骨髓间充质干细胞分泌细胞因子的方法，包括以下步骤：

（1）分离骨髓间充质干细胞进行原代培养，在细胞融合度达到80-90%后，用0.25%胰酶消化；

（2）将步骤（1）消化后的细胞用培养基重悬后接种至用羟丙基纤维素和泊洛沙姆188包被的培养瓶中，培养24h后进行半量换液，继续培养过程中每天补充一次培养基，每次补充的培养基中添加丹皮酚、金属硫蛋白-3、雷帕霉素，连续培养3天，收集培养液。

进一步地，步骤（2）中培养瓶包被过程为：将羟丙基纤维素和泊洛沙姆188加入至PBS中，在6℃过夜包被处理培养瓶，所述羟丙基纤维素在PBS中的浓度为5-10μg/mL，所述泊洛沙姆188在PBS中的浓度为1-5μg/mL。

进一步地，步骤（2）中所用培养基为DMEM/F12培养基。

进一步地，步骤（2）中培养基中添加丹皮酚、金属硫蛋白-3、雷帕霉素的浓度分别为：丹皮酚10-20ng/mL、金属硫蛋白-3 1-5ng/mL、雷帕霉素25-30ng/mL。

进一步地，步骤（2）中培养基中添加丹皮酚、金属硫蛋白-3、雷帕霉素的浓度分别为：丹皮酚15ng/mL、金属硫蛋白-3 3ng/mL、雷帕霉素27 ng/mL。

进一步地，步骤（2）中培养瓶中的细胞密度为1-5×10⁴个/mL，培养过程在37℃，5%CO₂的培养箱中进行。