[发明专利]一种新冠病毒(2019-nCoV)核酸提取效率的评价方法

说明书

本发明建立了一种评价新冠病毒(2019‑nCoV)核酸提取效率的方法，提取前采用流式分析技术结合免疫荧光探针技术精确定量检测2019‑nCoV病毒颗粒数，提取后使用数字PCR(dPCR)精确定量检测2019‑nCoV病毒核酸拷贝数，该核酸拷贝数与提取前测得的颗粒数的比值即为核酸提取效率。本方法可以识别并定量检测2019‑nCoV颗粒，可以准确评价2019‑nCoV核酸提取效率，且评价方式直接有效，评价结果可溯源。

技术领域：

本发明属于公共卫生领域，涉及新型冠状病毒的检测方法，特别涉及一种新冠病毒(2019-nCoV)核酸提取效率的评价方法。

背景技术：

实时荧光RT-PCR检测因具备灵敏度高、特异性强的特点，是目前检测新冠病毒核酸的主要方法。但随着检测工作的大量开展，人们发现荧光RT-PCR检测的阳性检出率仅仅为30％～50％。其中，最重要的原因是不同的核酸检测试剂核酸提取方法的效率不同。因此，需要对不同试剂盒的核酸提取方法的提取效率进行评价。

核酸提取效率，是指提取后与提取前的核酸拷贝数的比值。然而，2019-nCoV核酸在提取前是完全被包裹在病毒颗粒内部的，无法直接测定拷贝数。

目前常见的核酸提取效率评价方法，是采用不同提取方法对同一份样品进行提取并分别测量提取后的核酸拷贝数，来比较不同方法的提取效率的高低。但是这个方法只能得到一个相对的结果，无法真正计算方法的提取效率。

还有研究使用2019-nCoV核酸标准品取代病毒颗粒进行评价，即使用待评价的方法对核酸标准品进行一次提取操作，并通过测量提取过程中的核酸损失量来间接计算提取效率。然而该方法忽视了实际提取操作中，病毒裂解效率对提取效率的影响，使得评价结果不准确。

因此，只有准确测量2019-nCoV颗粒的数量，方可对核酸提取方法的提取效率进行准确有效的评价！

然而，目前尚无任何可以精确定量检测2019-nCoV颗粒的方法。国内外主流检测技术，包括核酸检测、抗体检测、抗原检测，都是单纯检测核酸或者单纯检测表面蛋白，无法证明样品中含有病毒颗粒，并且上述方法也无法精确检测病毒颗粒的数量。

综上所述，为了准确有效地评价新冠病毒(2019-nCoV)核酸提取效率，有必要开发一种能够精确定量检测2019-nCoV颗粒的方法，用于核酸提取前的病毒颗粒浓度测量。

发明内容：

本发明的目的是提供一种新冠病毒(2019-nCoV)核酸提取效率的评价方法，该方法首先必须能够实现2019-nCoV颗粒的精确定量检测。

因此，要达到上述发明目的，必须解决如下三个技术壁垒。

技术关键1：解决如何准确识别2019-nCoV颗粒的难点，建立新冠病毒的荧光标记方法。

需要克服的困难：

目前国内外主流检测技术，包括核酸检测、抗体检测、抗原检测，都是单纯检测核酸或者单纯检测表面蛋白，无法证明样品中含有病毒颗粒。

需要同时识别病毒表面特异性蛋白以及内部核酸，方可证明样品中含有病毒颗粒。虽然细菌的荧光标记方法已经很成熟，而病毒的荧光标记方法，尤其是新冠病毒，还存在许多待解决的问题：例如新冠病毒的核酸为RNA，而细菌的核酸是DNA。能用于细菌染色的荧光染料一般无法用于病毒染色。

解决的手段：

第一，研制出适合的2019-nCoV的特异性抗体。

选择2019-nCoV的S蛋白和N蛋白作为靶标，研制了2019-nCoV的S蛋白抗体和N蛋白抗体。将S蛋白抗体偶联红色荧光探针，将N蛋白抗体偶联橙色荧光探针。同时使用2种抗体对2019-nCoV进行特异性荧光标记，并使用流式分析仪对2019-nCoV的荧光进行分析。