[发明专利]新型冠状病毒NSP13基因的用途

说明书

本发明提供了新型冠状病毒NSP13基因的新用途，将新型冠状病毒NSP13基因制备成允许表达SARS‑CoV‑2NSP13蛋白的产品，其在真核细胞中表达的SARS‑CoV‑2NSP13蛋白，可以显著性地抑制真核表达质粒的表达，且SARS‑CoV‑2NSP13蛋白只抑制真核表达质粒的表达，但不抑制真核细胞基因组中基因的表达，进一步地，SARS‑CoV‑2NSP13蛋白是在mRNA水平抑制真核表达质粒的表达。本发明利用该发现首次将外源性蛋白引入真核细胞内用于抑制真核表达质粒表达，填补了之前对于外源质粒表达调控的技术上的空缺，为抑制细胞中游离基因的表达提出了新的思路。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及新型冠状病毒NSP13基因的新用途。

背景技术

对于大多数RNA病毒来讲，病毒RNA通常会在一些非翻译区或者是开放读码框(ORF)序列形成多种顺式作用元件，以在病毒的复制周期中发挥重要的作用。SARS-CoV-2作为一种有包膜的正链RNA病毒，它的非结构蛋白NSP13包含601个的氨基酸，是一种具有三磷酸核苷水解酶(NTPase)活性和RNA解旋酶活性的蛋白，也是构成病毒转录复制机器的两个核心组分之一。SARS-CoV-2NSP13整体结构类似于重症急性呼吸综合征(SARS)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS)的NSP13蛋白，呈金字塔状，由以下五个结构域组成：N端的锌指结构域(ZBD)和stalk结构域、1B结构域以及C端的解旋酶核心部分Rec A1和Rec A2结构域。在病毒的生活周期中，NSP13发挥其解旋酶活性将双链RNA解开进行下一轮RNA复制。在冠状病毒的进化过程中，NSP13蛋白表现出很高的保守性，目前NSP13具体以什么机制发挥生物学功能暂时还不太清楚，所以对NSP13蛋白的结构和功能的研究是非常重要的。

在1952年，美国的生物学家J.莱德伯格第一次引入质粒(plasmid)这个术语，即用来表述染色体以外的基因物质。质粒广泛存在于生物界，从细菌、真菌到植物甚至哺乳动物。已知的绝大多数质粒是环状双链DNA(共价闭环DNA,covalently closed circularDNA,cccDNA)，具有自主复制能力，可以在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并且表达所携带的遗传信息。对于一个质粒，最简单的形式包括一个复制起始位点(Origin ofreplication,ORI)负责质粒的复制起始，一段抗性基因用来快速筛选以及至少一个酶切位点便于外源基因的插入，这些元件可以保证质粒在细菌内扩增，同时允许携带质粒的细菌从不含质粒的细菌中分离出来，而酶切位点可以使外源DNA片段插入到质粒中。

正因为质粒这些特殊的属性，在遗传工程研究中常被用作运送外源基因的载体，近些年来，质粒载体在基因治疗中的应用已引起人们的关注，并有了很大的进展，与病毒载体相比，质粒的优点是制备简单、成本低廉、快捷，而且比较安全，能与其他合成载体联合使用。由于有些治疗不需要长期的一个外源基因的导入，或者是在治疗过程中出现外源核酸污染情况，而现有的技术无法灵活地消除外源基因。并且在生物界，一些质粒具有致病性，比如使昆虫致病甚至死亡的细菌毒素就是质粒编码的；还有一些质粒赋予宿主产生抗药性遗传，使宿主对抗生素、化学药物、重金属等杀菌剂表现出抗性，会阻止抗菌素进入细胞或者修饰抗菌素使其失活，甚至改变抗菌素作用的靶位点或者自身产生能代替宿主细胞中被抗菌素作用的靶酶，所以对于这一部分的质粒如何进行一个复制转录层面的负调控作用就显得尤为重要，这就需要根据不同的实验需求发明不同的实验技术。

检测和降解外来核酸是一种古老的宿主防御方式。然而，其根本机制尚不完全清楚。通常宿主细胞面对外源病毒或者转染基因的DNA或者RNA时，会触发其天然免疫信号，激活DNA感受器即一些toll样受体(Toll-like receptors,TLR)或者RNA感受器RIG样受体，从而引起一些抗病毒蛋白的上调，如一些核酸酶、拓扑异构酶等降解外源核酸，而这些抗病毒蛋白往往是由宿主基因控制的，目前没有报道过外源性蛋白可以在过表达的情况下抑制外源质粒的表达。因此，如何引入外源性蛋白抑制外源质粒的表达是一个亟待深入研究的课题。

发明内容