[发明专利]重金属铅检测试剂盒及方法

权利要求书

1.一种重金属铅检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括pb²⁺特异性脱氧核酶、环状双发卡脱氧核酶、分子信标及缓冲液，所述缓冲液含Mg²⁺，pH值范围为8-11，不包括蛋白质类酶或抗体；

所述pb²⁺特异性脱氧核酶是一类具有催化功能的DNA分子，其空间结构中存在活性中心，当其专一地与pb²⁺结合时，活性中心被激活；

所述环状双发卡脱氧核酶为在脱氧核酶的活性中心的第7-8个碱基位置添加两个发卡结构或第8-9个碱基位置添加两个发卡结构，且脱氧核酶的线性形式通过首尾连接得到的单链环状序列；所述环状双发卡脱氧核酶中含有核糖核苷酸位点，其余均为脱氧核糖核苷酸；所述的核糖核苷酸位点为pb²⁺特异性脱氧核酶的酶切位点；当所述酶切位点被酶切后，环状双发卡脱氧核酶断裂形成线性双发卡脱氧核酶；

所述分子信标是具有茎环结构的单链寡核苷酸，其环部含有与环状双发卡脱氧核酶结合臂的互补核酸片段，所述互补核酸片段的中间段为核糖核苷酸位点，其余均为脱氧核糖核苷酸；所述核糖核苷酸位点为线性双发卡脱氧核酶的酶切位点；所述分子信标带有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团和淬灭基团修饰在分子信标茎部结构的两端或内部，所述荧光基团和淬灭基团位于所述双发卡脱氧核酶的酶切位点的两侧。

2.根据权利要求1所述的重金属铅检测试剂盒，其特征在于，所述pb²⁺特异性脱氧核酶的酶切位点由1-2个核糖核苷酸组成；所述双发卡脱氧核酶酶切位点由1-2个连续的核糖核苷酸组成。

3.根据权利要求1所述的重金属铅检测试剂盒，其特征在于，所述荧光基团选自FITC、FAM、VIC、ROX、TET、Texas Red、HEX、TAMRA、Cy3、Cy5、Rhodamine B以及Perylene中的一种或多种；所述淬灭基团选自Dabcyl、NFQ、QYS-7、BHQ1、BHQ2、BHQ3、Anthraquinone以及TAMRA中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的重金属铅检测试剂盒，其特征在于，所述环状双发卡脱氧核酶采用如下方法制备：

采用预测核酸二级结构的软件模拟要合成的环状脱氧核酶的二级结构；在DNA连接酶的作用下连接成环时，另设计一条短链DNA splint作为辅助连接，连接处两端的双链互补部分为5-9 bp；先对设计的单链脱氧核酶的5’端进行磷酸化处理，然后在DNA连接酶的作用下首尾相连成环，成环条件为：加入20 μM的磷酸化链1 μL，20 μM的splint 2 μM，1×的T4Buffer 2 μL，5U的T4DNA连接酶0.5 μL，总体系为20 μL，在25℃条件下反应4 h-6 h；

或者采用如下方法制备：

在成环体系中加入5’端磷酸化修饰的双发卡脱氧核酶单链，CircLigase™ ssDNALigase II，1×CircLigase II Reaction Buffer，MnCl₂和甜菜碱，于PCR仪中经60℃恒温反应16 h后，80℃温浴10 min将酶灭活。

5.根据权利要求4所述的重金属铅检测试剂盒，其特征在于，环化反应结束后，先用核酸外切酶去除未环化的线性核酸链以及加入的辅助DNA splint；将酶切处理后的产物用12%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，然后进行切胶回收；在回收后的样品中加入有机溶剂，去除样品中的蛋白杂质；最后再用冰乙醇沉淀，浓缩回收环状双发卡脱氧核酶；然后用75%的乙醇洗涤产物，置于空气中挥发水分，得到纯净的环状脱氧核酶。

6.根据权利要求1所述的重金属铅检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测浓度为100 fM-1 μM。

7.一种重金属铅检测方法，所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的，其特征在于，包括：

将待测样品与权利要求1-6所述的重金属铅检测试剂盒中的pb²⁺特异性脱氧核酶、环状双发卡脱氧核酶、分子信标以及缓冲液混合后，在20℃~37℃条件下反应10 min~60 min；首先，Pb²⁺特异性脱氧核酶以环状双发卡脱氧核酶为底物进行酶切，生成线性双发卡脱氧核酶；然后线性双发卡脱氧核酶对分子信标进行酶切，使得分子信标两端修饰的荧光基团跟淬灭基团分离，分子信标释放荧光信号，最终将极微量的Pb²⁺转化为强荧光信号；利用酶标仪检测反应体系中的荧光值，并将该荧光值与未添加待检样品的对照组中的背景荧光值进行比较以判断待检样品中是否含有重金属铅。