[发明专利]一种硝磺草酮抗性菌株的筛选的方法在审
| 申请号： | 202110659350.9 | 申请日： | 2021-06-15 |
| 公开（公告）号： | CN113293122A | 公开（公告）日： | 2021-08-24 |
| 发明（设计）人： | 张磊;丁浩然;杨猷建;牛冬冬 | 申请（专利权）人： | 盐城金苗农业科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N1/36 | 分类号： | C12N1/36;C12N1/20;C12N9/02;C12N15/70;C12R1/06;C12R1/01 |
| 代理公司： | 镇江基德专利代理事务所(普通合伙) 32306 | 代理人： | 张敏 |
| 地址： | 224215 江苏省盐*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 硝磺草酮 抗性 菌株 筛选 方法 | ||
1.一种硝磺草酮抗性菌株的筛选的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：对表层土壤和下水道污泥的进行采样得到样品，称取2.0g样品加入到添加有2000μmol/L硝磺草酮的50mL MSM培养基中，在30℃，180r/m富集培养5d，得到培养物；
步骤二：然后将5mL培养物转移到50mL新鲜的MSM培养基中，继续培养5d，经过连续富集驯化5轮后，吸取1mL上清培养液并稀释涂布于TMSM平板上，挑取在平板上生长的单菌落反复划线，获得纯培养物，并经革兰氏染色法筛选获得其中的阴性菌；
步骤三：纯化得到的革兰氏阴性菌株转接至含有500μmol/L硝磺草酮的TMSM平板上，挑取能在平板上生长的菌株，然后转接到新的筛选平板上，转接过程中逐渐增加筛选平板上硝磺草酮的浓度以增加选择压力，最终筛选出硝磺草酮高度耐受菌株；
步骤四：以硝磺草酮高度耐受菌株基因组DNA为模板，根据引物对pET-Sthppd-F/pET-Sthppd-R，PCR扩增其hppd基因，对PCR产物进行回收纯化，然后利用同源重组的方式克隆至线性化的pET-29a(+)载体，构建好的pET-Sthppd表达载体转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，StHPPD重组蛋白在16℃、160r/m摇床中过夜诱导表达，利用Co2+柱进行蛋白纯化；
步骤五：将纯化的硝磺草酮抗性菌株进行筛选。
2.根据权利要求1所述的一种硝磺草酮抗性菌株的筛选的方法，其特征在于，所述MSM培养基的组分包括以下重量份原料：NaCl 0.5-1.0g/L，NH4Cl 0.5-1.0g/L，KH2PO4 0.3-0.7g/L，K2HPO4 1.3-1.7g/L，MgSO4·7H2O 0.1-0.3g/L，加超纯水至1L，并调节pH至7.0。
3.根据权利要求1所述的一种硝磺草酮抗性菌株的筛选的方法，其特征在于，所述TMSM培养基为MSM培养基添加1g/L的酪氨酸。
4.根据权利要求1所述的一种硝磺草酮抗性菌株的筛选的方法，其特征在于，所述硝磺草酮抗性菌株筛选的具体步骤为：从采集的土壤样品中共获得了96株能以酪氨酸为唯一碳源生长的细菌，分别编号为MST-1-MST-96，然后将96株菌分别逐渐转接至含有500-5000μmol/L硝磺草酮的TMSM平板上，在500μmol/L低浓度的硝磺草酮作为选择压力时，从中筛选获得了72株菌，在含有5000μmol/L硝磺草酮的TMSM平板上筛选到3株菌株。
5.根据权利要求4所述的一种硝磺草酮抗性菌株的筛选的方法，其特征在于，所述TMSM平板上筛选到3株菌株分别为MST-5、MST-32和MST-66。
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